PERCOBAAN ENZIM AMILASE DAN FAKTOR-FAKTORNYA

Enzim adalah golongan protein yang paling banyak terdapat dalam sel hidup. Sekarang, kira-kira lebih dari 2000 enzim telah teridentifikasi, yang masing-masing berfungsi sebagai katalisator reaksi kimia dalam sistem hidup. Sintesis enzim terjadi didalam sel dan sebagian besar enzim dapat diperoleh dengan ekstraksi dari jaringan tanpa merusak fungsinya. Contoh enzim diantaranya ptialin, pepsin, renin, amilase, tripsin, lipase, erepsin, maltase, sukrase dan laktase. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh suhu, pH, konsentrasi enzim, dan konsentrasi substrat.

Berikut ini beberapa percobaan mengenai enzim:

(Percobaan yang menggunakan enzim amilase dapat diambil dari saliva atau air liur. Untuk menstimulasi sekresi saliva, kunyahlah sepotong lilin (parafin) kemudian saring dan siap digunakan)

I.  Percobaan yang bertujuan mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi enzim, yaitu:

A.  Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim

Pada suhu sangat rendah, aktivitas enzim dapat terhenti secara reversibel. Kenaikan suhu lingkungan akan meningkatkan energi kinetik enzim dan frekuensi tumbukan antara molekul enzim dan substrat, sehingga enzim makin aktif. Umumnya kenaikan suhu 10°C menyebabkan kecepatan reaksi enzimatis bertambah 1,1 hingga 3,0 kali lebih besar. Pada suhu optimum, kecepatan reaksi enzimatis berlangsung maksimal. Bila suhu ditingkatkan terus, maka enzim akan mengalami denaturasi, sehingga aktivitas katalitiknya terhenti. Sebagian besar enzim memiliki suhu optimum 30°C sampai 40°C dan mengalami denaturasi secara irreversibel pada pemanasan di atas suhu 60°C.

Prosedur Pengujian:

1. Ke dalam 5 tabung reaksi di isi dengan 2 mL larutan amilum
2. Tambahkan 1 mL enzim amilase pada setiap tabung
3. Tabung 1 dimasukkan ke dalam gelas kimia yang berisi es; tabung 2 disimpan pada suhu kamar; tabung 3 dimasukan ke dalam penangas air bersuhu 37 - 40°C; tabung 4 dimasukan ke dalam penangas air bersuhu 75 - 80°C; tabung 5 dimasukkan ke dalam penangas air mendidih
4. Biarkan masing-masing tabung pada tempatnya selama 15 menit  
5. Selanjutnya, uji dengan larutan iodium
6. Uji pula dengan pereaksi benedict
7. Catat dan amati perubahan warna yang terjadi

Lakukanlah pengamatan dalam waktu yang sama dan sesuai dengan kondisi percobaan pada tiap tabung. Jangan menambahkan enzim secara serentak pada kelima tabung agar memudahkan sewaktu pengujian.

B.  Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim

Enzim bekerja pada kisaran pH tertentu dan umumnya tergantung pada pH lingkungannya. Enzim menunjukkan aktivitas maksimal pada pH optimum, umumnya antara pH 6 - 8,0. Jika pH rendah atau tinggi, maka dapat menyebabkan enzim mengalami denaturasi, sehingga menurunkan aktivitasnya.

Terjadinya penurunan aktivitas enzim dapat dilihat dari hasil hidrolisis substrat yang dikatalisis. Misalnya, amilum terhidrolisis menjadi maltosa atau glukosa. Hasil hidrolisis dapat dibuktikan dengan uji benedict. Bila positif, berarti amilum terhidrolisis, sehingga dapat diasumsikan enzim memiliki aktivitas tinggi. Sebaliknya, bila hasilnya negatif berarti amilum tidak terhidrolisis karena enzim tidak aktif atau mengalami penurunan aktivitas.

Prosedur Pengujian:

1. Isilah tabung reaksi 1 dengan 2 mL larutan HCl 0,4%; tabung 2 dengan 2 mL aquades; tabung 3 dengan 2 mL Na₂CO₃ 1%
2. Ke dalam tiap tabung ditambahkan 2 mL larutan amilum dan 1 mL enzim
3. Campur sampai homogen dan biarkan selama 15 menit
4. Selanjutnya, tiap tabung diuji dengan larutan iodium dan benedict 

C.  Pengaruh konsentrasi enzim terhadap aktivitas enzim

Tujuan percobaan ini adalah mengetahui konsentrasi enzim terhadap perombakan suatu substrat (amilum)

Pada konsentrasi substrat tertentu, bertambahnya konsentrasi enzim secara bertingkat akan menaikkan kecepatan reaksi enzimatis. Dengan kata lain, semakin besar volume atau konsentrasi enzim, semakin tinggi pula aktivitas enzim dalam memecah substrat yang dikatalisis. Hal ini dapat diihat dari perbedaan warna yang terjadi melalui uji iodium atau adanya endapan yang terbentuk melalui uji benedict.

Prosedur Pengujian:

1. Isilah tabung 1 dengan 0,5 mL enzim amilase; tabung 2 dengan 1,0 mL enzim amilase; tabung 3 dengan 1,5 mL enzim amilase
2. Ke dalam tiap tabung, ditambahkan 2 mL larutan amilum 2%
3. Campurlah dengan baik dan diamkan selama 15 menit
4. Lalu ujilah dengan dengan larutan iodium dan pereaksi Benedict
5. Amati dan catat perubahan yang terjadi

D.  Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim

Pada konsentrasi enzim yang tetap, penambahan konsentrasi substrat akan menaikkan kecepatan maksimum yang tetap. Penambahan substrat setelah kecepatan maksimum tidak berpengaruh lagi, sebab telah melampaui titik jenuh enzim.

Prosedur Pengujian:

1. ke dalam 4 tabung reaksi di isi masing-masing dengan larutan amilum 1 mL, 2 mL, 4 mL dan 6 mL
2. Ke dalam tiap tabung dimasukkan 1 mL enzim amilase
3. Campurlah dengan baik dan ujikah dengan larutan iodium dan pereaksi Benedict 
4. Amati dan catat perubahan yang terjadi

II.  Percobaan yang bertujuan identifikasi enzim

A.  Uji Urease

Uji urase bertujuan untuk membuktikan adanya enzim urease dalam suatu sampel (suspensi kedelai).

Substrat urea oleh enzim urease di dalam suspensi sampel (misalnya suspensi kedelai) akan diuraikan menjadi ammonia dan gas karbondioksida

CO(NH₂)₂  +  H₂O  +  urease --->  2NH₃(g)  +  CO₂(g)

Senyawa ammonia yang dihasilkan bersifat basa, sehingga pH larutan menjadi naik. Akibatnya fenolftalein dalam larutan yang semula tidak berwarna berubah menjadi warna merah muda. Aktivitas enzim urease dapat dihambat oleh inhibitor logam berar seperti Hg²⁺ atau Pb²⁺ dan dirusak oleh pemanasan 100°C

Prosedur pengujian:

1. Isilah 3 tabung reaksi masing-masing dengan 1 mL larutan urea 1%
2. Selanjutnya pada tabung 1 ditambahkan 10 tetes filtrat kedelai dan 2 tetes fenolftalein; pada tabung 2 ditambahkan 10 tetes filtrat kedelai yang telah dididihkan dan 2 tetes fenolftalein; pada tabung 3 ditambahkan 10 tetes filtrat kedelai, 2 tetes fenolftalein dan 10 tetes larutan HgCl₂ 1%
3. Campurlah dengan baik dan masukkan ketiga tabung ke dalam penangas air pada 37 - 40°C selama 5 menit
4. Amati perubahan warna yang terjadi

B.  Uji Peroksidase

Uji peroksidase bertujuan untuk membuktikan adanya enzim peroksidase dalam suatu sampel (susu segar).

Hidrogen peroksida (H₂O₂) oleh enzim peroksidase dalam sampel (misalnya susu segar) akan direduksi menjadi H₂O. Sebagai donor hidrogen digunakan guaiak yang akan teroksidasi menjadi senyawa yang berwarna biru.

2H₂O₂  +  guaiak  + peroksidase  --->  Guaiak teroksidasi  + 2H₂O

                                                                     Biru

*Larutan Guaiak dibuat dari 1,0 gram guaiak dalam 60 mL alkohol 95%

Prosedur pengujian:

1. Ke dalam 2 tabung reaksi masing-masing dimasukkan 2 mL larutan segar
2. Panaskan tabung pertama sampai mendidih, lalu dinginkan perlahan-lahan dibawah air kran sedangkan tabung kedua tidak dididihkan.
3. Ke dalam tiap tabung, tambahkan 5 tetes larutan guaiak dan 2-3 tetes H₂O₂  3%
4. Catat dan amati perubahan warna yang terjadi

C.  Uji Gmelin

Uji Gmelin bertujuan membuktikan adanya pigmen-pigmen dalam empedu

Empedu mengandung bermacam-macam pigmen. Pigmen empedu yang utama adalah biliverdin yang berwarna hijau dan bilirubin yang berwarna jingga atau kuning coklat. Oksidasi pigmen-pigmen empedu oleh oksidator kuat seperti HNO₃, akan menghasilkan turunan senyawa yang berwarna misalnya:

     Mesobiliverdin  :  hijau - biru

     Mesobilirubin    : kuning

     Mesobilisianin   : biru - ungu atau violet

Prosedur pengujian:

1. Siapkan 2 tabung reaksi bersih. Tabung 1 dimasukkan 1 mL HNO₃ pekat dan tabung 2 dimasukkan 1 mL larutan iodium 0,5%
2. Dinding tabung dimiringkan dan tambahkan kedalam masing-masing tabung 1 mL larutan empedu sehingga kedua larutan tidak bercampur
3. Perhatikan warna yang terbentuk pada perbatasan antara kedua cairan

D.  Uji Pettenkofer

Uji pettenkofer bertujuan untuk membuktikan adanya asam empedu di dalam larutan empedu

Di dalam empedu, asam-asam empedu seperti asam kholat atau asam kenodeosikolat terutama sebagai garamnya, merupakan turunan senyawa aromatik kompleks. Asam empedu dengan furfural (dihasilkan dari dehidrasi karbohidrat oleh asam sulfat pekat) akan berkondensasi membentuk senyawa kompleks berwarna.

Prosedur pengujian:

* Larutan empedu encer (1 : 10)

1. Masukkan 1 mL larutan empedu encer ke dalam tabung reaksi 
2. Tambahkan 2 tetes larutan sukrosa 5 %
3. Miringkan dinding tabung dan masukkan hati-hati 10 tetes H₂SO₄ pekat sehingga terbentuk dua lapisan cairan
4. Perhatikan terbentuknya cincin warna merah-violet pada perbatasan antara kedua lapisan