MACAM - MACAM PENGUJIAN ENZIM

A.  UJI MOLISCH

Uji molisch bertujuan membuktikan adanya karbohidrat secara kualitatif. Identifikasi karbohidrat oleh molisch didasarkan pada hidrolisis karbohidrat oleh asam sulfat pekat yang menghasilkan monosakarida. Dehidrasi monosakarida jenis pentosa oleh asam sulfat pekat menghasilkan furfural. Sedangkan golongan heksosa dihidrolisis oleh asam sulfat pekat menjadi hidroksi-metil furfural. Pereaksi molisch terdiri atas alfa-naftol dalam alkohol akan bereaksi dengan furfural membentuk senyawa kompleks berwarna ungu.

Pereaksi Molisch dibuat dengan melarutkan 12,5 gram alfa-naftol ke dalam alkohol 95% sampai volumenya tepat 250 mL. Pereaksi ini dibuat baru setiap kali digunakan.

Prosedur uji molisch:

1. Masukan 15 tetes larutan uji ke dalam tabung reaksi

2. Tambahkan 3 tetes pereksi molisch dan kocok dengan baik

3. Miringkan tabung reaksi, lalu alirkan dengan hati-hati 1 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung agar

    tidak bercampur.

(Uji ini positif adanya karbohidrat jika terbentuk cincin berwarna ungu pada batas antara kedua lapisan)

B.  UJI IODIUM

Uji Iodium bertujuan membuktikan adanya polisakarida (amilum, glikogen, dan dekstrin). Identifikasi ini didasarkan pada pembentukan kompleks adsorpsi berwarna spesifik oleh polisakarida akibat penambahan iodium. Amilum atau pati dengan iodium menghasilkan berwarna biru, dekstrin menghasilkan warna merah anggur sedangkan glikogen dan sebagian pati terhidrolisis bereaksi dengan iodium membentuk warna merah coklat.

Larutan Iodium 0,01 M dibuat dengan melarutkan 1,26 gram iod (I₂) dan 2-2,5 gram Kalium Iodida (KI) dalam air sampai 1 Liter.

Prosedur Kerja

1.  Masukkan 3 tetes larutan uji ke dalam tabung reaksi

2.  Tambahkan 2 tetes larutan iodium

3.  Amati warna spesifik yang muncul

C.  UJI BENEDICT

Uji Benedict bertujuan membuktikan adanya gula reduksi. Pengujian ini berdasarkan  gula yang mempunyai gugus aldehida atau keton bebas mereduksi ion Cu²⁺ dalam suasana alakalis menjadi Cu⁺ yang mengendap sebagai Cu₂O berwarna merah bata.

Pereaksi Benedict dibuat dengan melarutkan 173 gram kristal natrium sitrat dan 100 gram natrium karbonat anhidrous di dalam 800 mL air. Aduklah, lalu saring. Kemudian, ke dalamnya ditambahkan 17,3 gram tembaga sulfat yang telah dilarutkan dalam 100 mL air. Buat volume total 1 liter dengan penambahan air.

Prosedur Kerja

1.  Masukkan 5 tetes larutan uji dengan 15 tetes pereaksi benedict. Campulah dengan baik

2.  Didihkan di atas api kecil selama 2 menit atau masukkan dalam penangas air mendidih selama 2 menit

3.  Dinginkan perlahan-lahan

4. Perhatikan warna yang terbentuk

(Reaksi positif ditandai dengan timbulnya endapan warna biru kehijauan, kuning, atau merah bata terkandung  kadar gula pereduksi yang ada. Uji benedict dapat pula digunakan untuk menentukan kadar gula dalam urin secara semikuantitatif)

Warna	Penilaian	Konsentrasi
Biru/ Hijau Keruh	-	-
Hijau/ Hijau Kekuningan	+1	kurang dari 0,5%
Kuning Kehijauan/ Kuning Keruh	+2	0,5 - 1,0%
Jingga	+3	1,0 - 2,0%
Merah Bata	+4	Lebih dari 2%

D.  UJI BARFOED

Uji Barfoed bertujuan membedakan antara monosakarida dengan disakarida. Dasar dari pengujian ini adalah ion Cu²⁺  dari pereaksi Barfoed dalam suasana asam akan direduksi lebih cepat oleh gula reduksi monosakarida daripada disakarida dan menghasilkan endapan Cu₂O berwarna merah bata.

Pereaksi Barfoed dibuat dengan melarutkan 13,3 gram kristal tembaga asetat dalam 200 mL air, saring bila perlu. Kemudian tambahkan 1,9 mL asam asetat glasial. Pereaksi dibuat baru setiap kali digunakan.

Prosedur Kerja

1.  Masukan ke dalam tabung reaksi 10 tetes larutan uji dan 10 tetes pereaksi barfoed

2.  Campurlah dengan baik dan panaskan di atas api kecil sampai mendidih selama 1 menit atau masukkan dalam penangas air mendidih selama 3 menit

3.  Perhatikan warna yang terbentuk

(Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya endapan Cu₂O berwarna merah bata)

E.  UJI BIAL

Uji Bial bertujuan membuktikan adanya pentosa. Dasar teori dari uji bial adalah dehidrasi pentosa oleh HCl pekat menghasilkan furfural dan dengan penambahan orsinol (3,5-dihidroksi toluena) akan berkondensasi membentuk senyawa kompleks berwarna biru.

Pereaksi Bial dibuat dengan melarutkan 5,0 gram orsinol dalam alkohol 95% sampai volume 100 mL

Prosedur Kerja

1.  Masukan ke dalam tabung reaksi 5 tetes larutan uji dan 10 tetes pereaksi bial

2.  tambahkan HCl pekat campurlah dengan baik

3. Panaskan dalam api kecil sampai timbul gelembung-gelembung gas ke permukaan larutan

4.  Perhatikan warna atau endapan yang terbentuk

(terbentuknya warna biru menunjukkan adanya pentosa)

F.  UJI SELIWANOFF

Uji seliwanoff bertujuan membuktikan adanya ketosa (fruktosa). Dasar teorinya adalah dehidrasi fruktosa oleh HCl pekat menghasilkan hidroksimetilfurfural dan dengan penambahan resorcinol akan mengalami kondensasi membentuk senyawa kompleks berwarna merah oranye.

Pereaksi Seliwanoff dibuat dengan mencampurkan 3,5 mL resorcinol 0,5% dengan 12 mL HCl pekat, lalu encerkan dengan akuades sampai 35 mL

Prosedur Kerja

1.  Masukkan 5 tetes larutan uji dan 15 tetes pereaksi seliwanoff ke dalam tabung reaksi

2.  Didihkan dalam api kecil selama 30 detik atau dalam penangas air mendidih selama 1 menit

3.  Hasil positif dengan ditandainya terbentuk warna merah oranye

G. UJI OSAZON

Uji Osazon bertujuan membedakan bermacam-macam karbohidrat dari gambar kristalnya. Dasar teorinya adalah semua karbohidrat yang mempunyai gugus aldehida atau keton bebas akan membentuk hidrazon atau osazon bila dipanaskan bersama fenilhidrazin berlebih. Osazon yang terjadi mempunyai bentuk kristal dan titik lebur yang spesifik. Osazon dari disakarida larut dalam air mendidih dan terbentuk kembali bila didinginkan. Namun, sukrosa tidak membentuk osazon karena gugus aldehida atau keton yang terikat pada monomernya sudah tidak bebas. Sebaliknya, osazon dari monosakarida tidak larut dalam air mendidih. 

Prosedur Kerja

1.  Masukan 2 mL larutan uji ke dalam tabung reaksi

2.  Tambahkan seujung spatula fenilhidrazin-hidroklorida dan kristal natrium asetat

3.  Panaskan dalam penangas air selama beberapa menit

4.  Dinginkan perlahan-lahan dalam air keran

5.  Perhatikan kristal yang terbentuk dan identifikasi di bawah mikroskop 

H. UJI ASAM MUSAT

Uji asam musat bertujuan membedakan antara glukosa dan galaktosa. Dasar teorinya adalah oksidasi terhadap karbohidrat dengan asam nitrat pekat akan menghasilkan asam yang dapat larut. Namun, laktosa dan galaktosa menghasilkan asam musat yang tidak dapat larut.

Prosedur Kerja

1.  Masukkan 10 tetes larutan uji dan 2 tetes asam nitrat pekat

2.  Panaskan dalam penangas air mendidih sampai volumenya kira-kira tersisa 2-3 tetes

3.  Dinginkan perlahan-lahan, lalu perhatikan terbentuknya kristal-kristal keras seperti pasir

4.  Amatilah di bawah mikroskop