PEMBUATAN ENZIM AMILASE

I.       TUJUAN

? Setelah melakukan praktikum, mahasiswa diharapkan mengetahui mekanisme pembuatan enzim a amilase dan pengujian akan daya aktifitasnya.

II.    PERINCIHAN KERJA

? Pembuatan inokulum,

? Fermentasi,

? Pemisahan,

? Pengujian aktivitas enzim.

III. ALAT yang DIGUNAKAN

? Spektrofometri Sinar Tampak Perkin Elmer

? Inkubator Shaker dan Inkubator Enzim

? Auto Clave dan Centrifuge

? Pipet Tetes Mikron

? Erlenmeyer 250 ml

? Hot Plate dan Pengaduk

? Timbangan

IV. BAHAN yang DIPAKAI

? Mikroba Enzim a amilase

? Ragi 2 gram serta Sagu 2 gram

? KH₂PO₄ 0,2 gram

? HCl 0,1N dan Kalium Iodida

? Aquadest

V.    DASAR TEORI

Enzim adalah substansi yang dihasilkan oleh sel-sel hidup dan berperan sebagai katalisator pada reaksi kimia yang berlangsung dalam organisme (P.M.Gaman-K.B.Sherrington,1994). Semua sel menghasilkan sejumlah besar enzim yang berbeda-beda dan fungsi sel ditentukan oleh enzim yang terdapat di dalamnya.

Enzim sangat aktif dalam banyak hal, hanya beberapa molekul enzim saja yang diperlukan untuk mrngkatalis sejumlah substrat. Hal ini dimungkinkan karena protein enzim dapat dipakai berulang-ulang. Molekul enzim berikatan dengan substrat dalam waktu singkat, mengubahnya menjadi produk, melepaskan produk dan setelah bebas dapat dipakai untuk mengikat molekul substrat lainnya (Suhartono,1989). Suatu enzim menpunyai ukuran yang lebih besar dari pada substrat. Oleh karena itu, tidak seluruh bagian enzim dapat berhubungan dengan substrat. Hubungan antara subatrat dan enzim hanya terjadi pada tempat atau bagian tertentu saja. Tempat atau bagian enzim yang mengadakan hubungan atau kontak dengan substrat disebut bagian aktif (Active site). Hubungan atau kontak antara enzim dengan substrat menyebabkan terjadinya kompleks enzim-substrat. kompleks ini merupakan kompleks aktif, yang bersifat sementara dan akan terurai lagi apabila reaksi yang diinginkan telah terjadi (Poedjiadi,1994).

Sumber enzim a amilase sangat beragam mulai dari tanaman, jaringan mamalia bahkan mikroorganisme. Enzim a amilase dari malt merupakan salah satu contoh jenis yang dihasilkan dari tanaman, dari mamalia enzim ini dapat dihasilkan dari ludah dan pankreas. Sumber a amilase yang paling potensial adalah mikroorganisme yang telah banyak digunakan dalam bidang industri (Judoamidjojo, et al,1989). Enzim ini mempunyai 2 golongan, yaitu termostabil yang tahan pada suhu tinggi dan termolabil pada suhu tinggi. Endoamilase tahan panas biasanya berasal dari bakteri, sedangkan yang tidak tahan panas berasal dari kapang (Fogarty,1983).

Enzim a amilase yang berasal dari bakteri (bacterial a amilase) merupakan endoenzim yang memotong ikatan a-1,4 amilosa dan amilopektin dengan cepat pada larutan pati kental yang telah mengalami gelatinasi. Proses ini juga dikenal dengan proses likuifikasi pati. Produk akhir yang dihasilkan dari aktivitasnya adalah dekstrin beserta sejumlah kecil glukosa dan maltosa. Enzim a amilase dapat diperoleh dari Bacillus licheniformis dan Bacillus subtilis yang telah luas digunakan dalam proses hidrolisis (likuifikasi) secara komersial oleh karena ketahanannya terhadap panas hingga 90°C bahkan ada yang mencapai 100°C (Triwiyono,1996).

Enzim a amilase yang berasal dari kapang (fungal a-amilase) dapat diperoleh dari Aspergillus niger dan Aspergillus oryzac. Enzim ini sangat berbeda dari Bacterial a-amilase karena jenis ini memiliki suhu deaktivasi yang rendah, aksi sakarifikasi yang tinggi serta nilai pH optimum yang rendah (pH 4 – 5). Enzim ini banyak digunakan dalam industri roti serta industri sirup maltosa dimana pH rendah dibutuhkan untuk mendegradasi pati (Prave, et al,1987). Enzim a amilase yang termolabil dari kapang digunakan dalam proses sakarifikasi (Triwiyono,1996). enzim ini mempunyai nama lain a-1,4 glukan-glukanohidrolase atau EC 3.2.1.1 (Judoamidjojo, et al,1989).

Enzim a amilase stabil pada kisaran pH 5,5 – 8,0. Aktivitas a-amilase ditentukan dengan mengukur hasil degradasi pati yang diamati dari penurunan kadar pati larut, kadar maltosa atau mengukur viskositas dan jumlah terbentuknya gula pereduksi pada aktivitas optimumnya secara normal yaitu pH 4,8 – 6,5 (Fogarty,1983).

Menurut Comission on Enzymes of The International Union Biochemistry, unit enzim adalah jumlah enzim yang mengkatalis pembentukan satu mikromol produk per menit dibawah kondisi tertentu. Enzim tidak murni dapat pula dinyatakan dalam unit per mililiter (Reed,1975). Maka dapat dikatakan bahwa satu unit enzim a amilase adalah satu mikromol a/b maltosa yang terbentuk per menit pada suhu dan pH aktivitasnya (Bernfeld,1955).

VI. PROSEDUR PENGERJAAN  

? Pembuatan Media Agar Miring ( ini tidak dilakukan karena bahan enzim telah ada)

ª  Agar 1,5 gram

ª  Glukosa 2 gram

ª  Ekstrak Tauge 100 ml

ª  pH 6

? Keseluruhan bahan diatas dimasukkan kedalam gelas kimia 500 ml dan dilakukan pasteurisasi lalu dilakukan penggoresan didalam kotak kaca dan dimasukkan kedalam inkubator enzim.

? Pembuatan Media Produksi

ª  Ditimbang masing-masing bahan, ragi sebanyak 2 gram, sagu 2 gram dan KH₂PO₄ sebanyak 0,2 gram.

ª  Setelah itu ragi dimasukkan kedalam gelas kimia 250 ml dan ditambahkan aquadest sebanyak 200 ml, lalu diaduk terus sampai larutannya menjadi panas, setelah itu ditambahkan KH₂PO₄ sebanyak 0,2 gram dan diaduk sampai larutannya betul-betul panas (tidak sampai mendidih),

ª  Lalu dimasukkan sagu sebanyak 2 gram dan tetap diaduk terus,

ª  Kemudian larutan tersebut dipindahkan ke dalam erlenmeyer 250 ml, setelah itu dipanaskan kembali dan diusahakan agar volume dalam erlenmeyer tersebut tetap konstan sebanyak 200 ml.

ª  Setelah itu erlenmeyer ditutup dengan kapas dan almunium foil, lalu dimasukkan ke dalam auto clave, diset suhunya sebesar 120°C dan tekanan 2 bar, setelah kondisi optimum ini tercapai maka dilakukan pasteurisasi selama 15 menit.

ª  Setelah itu, sampel ditunggu sampai dingin, dan dilakukan penanaman mikroba enzim a amilase didalam kotak inkubasi dengan menggunakan ose.

ª  Setelah itu dimasukkan kedalam inkubator shaker dan ditunggu sampai 1 minggu.

ª  Setelah itu larutan sampel diambil dan dimasukkan kedalam tabung centrifuge dan dipusingkan selama 15 menit dengan kecepatan pemusingan 150 rpm.

ª  Setelah itu diambil cairan jernihnya dan disaring,

? Pengujian aktivitas Enzim a Amilase

ª  Dipipet 0,250 ml Enzim ke dalam tabung reaksi (250 ml) dengan menggunakan pipet mikron, lalu ditambahkan pati larut 0,1% sebanyak 250 ml (ini untuk sampel).

ª  Dipipet lagi 250 ml Enzim kedalam tabung reaksi dengan menggunakan pipet mikron, lalu ditambahkan 250 ml pati larut 0,1% serta HCl 1 N sebanyak 250 ml (ini sampel untuk kontrol).

ª  Setelah itu kedua sampel diatas diinkubasi dengan suhu 50°C selama 15 menit,

ª  (Khusus untuk sampel) ditambahkan 250 ml HCl 1N.

ª  Setelah itu keduanya ditambahkan KI 2 % sebanyak 250 ml dan diberikan aquadest sebanyak 1 ml,

ª  Kemudian masing-masing sampel dicari panjang gelombang serapan maksimumnya pada lamda 600 nm.

VII.          Data pengamatan

? Kelompok I

ª Sampel : 0,088

ª Kontrol : 0,093

? Kelompok II

ª Sampel : 0,090

ª Kontrol : 0,130

? Kelompok III

ª Sampel : 0,372

ª Kontrol : 1,360

? Warna larutan Kontrol biru tua,

? Warna larutan Sampel biru muda dan sedikit kekuning-kuningan

VIII.   Perhitungan

Keterangan :

dp      =    jumlah Amilase yang menyebabkan penurunan Intensitas warna biru kompleks pati dan Iodium sebanyak 10 % dalam kondisi uji.

Fp      =    Faktor pengenceran (dari 200 ml diambil sebanyak 0,25 ml)

10%   =    Faktor pemragi (kandungan ragi didalam sampel)

K       =    Absorbansi Kontrol

S        =    Absorbansi Sampel

? Jumlah Produksi enzim a amilase  (untuk kelompok I)

dp  = 4,301 per mililiter

? Jumlah Produksi enzim a amilase  (untuk kelompok II)

dp  = 24,616 per mililiter

? Jumlah Produksi enzim a amilase  (untuk kelompok III)

dp  = 58,118 per mililiter

IX. Pembahasan hasil percobaan

? Pada pengujian daya aktivitas enzim a amilase dibuat 2 jenis larutan yaitu Kontrol dan Sampel, kegunaan dari kontrol adalah sebagai bahan referensi/pembanding bagi sampel yang menyempatkan enzim a amilase untuk melakukan kebiasaannya untuk merupah pati menjadi glukosa, dan jika kita melihat larutan kontrol, larutannya berwarna biru tua, hal ini disebabkan karena pada pati mengandung struktur glukosa yang lebih kompleks sehingga jika ditambahkan Iodium (dalam hal ini KI 2%) maka akan terbentuk warna biru, dan enzim a amilase belum sempat melakukan perombakan patinya menjadi glukosa sederhana kita telah melakukan penstopan pada enzim ini sehingga warna birunya masi tetap biru tua, sedangkan pada sampel warnanya menjadi biru muda karena sebagian pati telah menjadi glukosa yang sederhana sewaktu dilakukan inkubazi terhadap enzim a amilase, dengan kata lain sewaktu inkubasi enzim a amilase sempat merubah sebahagian pati menjadi glukosa sehingga warnanya memudar dari biru tua ke biru muda dengan sedikit warna kekuningan.

? Penambahan HCl pada larutan kontrol adalah untuk mencegah agar enzin a amilase tidak melakukan aktifitasnya untuk merombak struktur pati menjadi glukosa sebelum larutan ini dipanaskan pada inkubasi enzim, begitu pula dengan larutan sampel yang ditambahkan HCl, sebenarnya guna dari HCl adalah untuk menstopkan daya kerja enzim a amilase sehingga struktur patinya tidak mengalami perombakan yang banyak.

? Untuk kontrol mempunyai nilai absoransi yang tinggi, disebabkan karena sewaktu pengukuran panjang gelombang dengan menggunakan spektrofotometri sinar tampak dipergunakan panjang gelombang 600 nm dimana ini sebenarnya adalah panjang gelombang dari lamda maks untuk pati, sedangkan sampel mempunyai panjang gelombang yang lebih rendah dari kontrol karena memang secara keseluruhan sampel sudah bukan mengandung pati semua tetapi mengandung pula glukosa.

? Nilai dp sebesar 24,616 yang diperoleh adalah kemampuan  enzim a amilase yang sempat terbentuk didalam media sebanyak 200 ml yang mempunyai daya aktivitas untuk mengubah pati menjadi glukosa, sedangkan untuk daya aktivitas enzim a amilase yang kami peroleh kalah aktif dengan yang dipunyai kelompok III, disebabkan waktu ideal untuk memeroleh enzim a amilase yang produktif yaitu sekitar hari ke 4, sedangkan yang kami punyai telah melampaui masa itu yaitu hampir 7 hari, dengan kata lain enzim a amilase yang kami peroleh mempunyai daya aktivitas enzim yang kurang produktif lagi, karena khusus untuk sampel kelompok III sebenarnya berasal dari enzim 4 hari yang media penyimpanannya pula didalam lemari es (bukan enzim yang dibuat bersama kelompok II dsan kelompok I), itulah sebabnya daya aktifitas enzimnya tinggi

X.    Kesimpulan

? Waktu idel untuk pemanfaatan enzim a amilase sebenarnya adalah pada hari ke 4 setelah masa inkubasinya,

? HCl dapat digunakan untuk menghentikan daya kerja dari enzim a amilase.

? Enzim a amilase dapat digunakan sebagai pengurai pati menjadi glukosa.

XI. DaFTAR PUSTAKA

? Petunjuk praktikum Teknologi Bioproses Teknik Kimia Politeknik Negeri Ujung Pandang.