Pendahuluan
Pewarnaan
gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram
negative, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode
tersebut diberi nama berdasarka penemunya ilmuwan Denmark, Hans
Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun
1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella pneumonia (Karmana 2008).
Bakteri
garam positif adalah bakteri yang mempertahanka zat warna metil ungu
atau Kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis tersebut
akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram
negative akan berwarna merah muda atau merah. Perbedaan klasifikasi
antara kedua jenis bakteri tersebut terutama didasarkan pada perbedaan
struktur dinding sel bakteri (Karmana 2008).
Bakteri
gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu atau kristal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif
akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol,
sementara bakteri gram negative tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu
pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metal ungu atau
Kristal ungu, yang membuat semua bakteri gram negative menjadi berwarna
merah atau merah muda. Pengujian tersebut berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri tersebut berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka (Karmana 2008).
Metode
pewarnaan spora berfungsi untuk mempermudah pengamatan agar peneliti
atau pengamat mampu melihat spora, membedakan dengan sel vegetative
ataupun mengamati bentuknya. Endospora tidak mudah diwarnai dengan zat
pewarna pada umumnya. Hal tersebut yang menjadi dasar dari metode
pengecatan endospora dengan larutan hijau malasit. Metode Shaeffor,
foton endospora diwarnai pertama dengan larutan hijau malasit.
Pengecatan tersebut sifatnya kuat karena dapat berpenetrasi ke dalam
endospora dengan perlakuan larutan hijau malasit. Teknik tersebut akan
menghasilkan warna hijau pada endospora dan merah pada sel vegetative
(James 2002).
Tujuan
Praktikum bertujuan mewarnai dan mengidentifikasi bakteri dan spora di bawah mikroskop.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan ialah kawat ose, tabung eppendorf, spirtus, kaca preparat, dan mikroskop electron.
Bahan-bahan
yang digunakan ialah aquades, alcohol 70%, kristal violet atau kristal
ungu, Kalium Iodida (KI), Alkohol 96%, safranin, minyak imersi, dan
malasit green.
Prosedur
Pewarnaan Gram
Suasana
steril harus diciptakan dari awal praktikum hingga akhir praktikum.
Terlebih dahulu, tangan dicuci dengan sabun dan dibilas dengan air
hingga bersih. Tangan dikeringkan dan kemudian tangan dan meja dibasahi
dengan alcohol 70% hingga tangan dan area kerja steril serta kering.
Alat dan bahan yang akan digunakan disiapkan. Biakan bakteri diambil
dari tabung eppendorf menggunakan kawat ose yang telah disterilkan
sebelumnya, dengan cara kawat ose dibakar di atas spirtus hingga
memijar, kemudian didinginkan dan setelah dingin dimasukkan ke dalam
tabung eppendorf untuk pengambilan bakteri. Bakteri yang diambil harus
ditotolkan pada kaca preparat dalam jumlah yang cukup banyak. Kemudian
fiksasi udara dilakukan atau dikeringkan dengan udara. Setelah biakan
cairan kering, kristal violet atau ungu kristal diteteskan diatas biakan
bakteri tersebut hingga rata menutupi area bakteri. Kristal ungu
dibiarkan melekat hingga satu menit sambil digoyan-goyangkan. Lalu
dibilas dengan aquades dari bagian samping kaca preparat hingga mengalir
dan jangan langsung terkena biakan bakterinya. Kaca preparat dikering
udarakan kembali, lalu diteteskan KI (Kalium Iodida) hingga menutupi
seluruh area biakan bakteri dan dibiarkan selama satu menit. Lalu
dibilas kembali dengan aquades dan dikering udarakan. Biakan bakteri
diteteskan kembali dengan alcohol 96% secara merata selama 30 detik.
Lalu biakan bakteri dibilas atau dicuci lagi dengan aquades dan dikering
udarakan. Safrani dieteskan pada biakan bakteri secara merata dan
didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, dibilas dengan aquades dan
dikering udarakan. Kemudian kaca preparat berisi bakteri tersebut
diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000x dan memakai minyak
imersi.
Pewarnaan Spora
Suasana
steril harus diciptakan dari awal praktikum hingga akhir praktikum.
Terlebih dahulu, tangan dicuci dengan sabun dan dibilas dengan air
hingga bersih. Tangan dikeringkan dan kemudian tangan dan meja dibasahi
dengan alcohol 70% hingga tangan dan area kerja steril serta kering.
Alat dan bahan yang akan digunakan disiapkan. Pewarnaan spora dilakukan
dengan cara biakan bakteri diambil dengan kawat ose yang telah
disterilkan terlebih dahulu dengan cara menotolkannya di atas kaca
preparat dalam jumlah yang cukup banyak. Kemudian fiksasi udara atau
dikering udarakan. Malasit green diteteskan pada biakan bakteri hingga
menutupi area bakteri. Lalu difiksasi panas atau dipanaska di atas
Bunsen namun jangan terlalu dekat dengan api. Setelah itu safranin
diteteskan dan didiamkan selama 30 detik. Kemudian dibilas dengan
aquades dan dikering udarakan, serta diamati di bawah mikroskop.
Data dan Hasil Pengamatan
Tabel 1. Hasil Pewarnaan Gram
|
Sample (Tabung)
|
Gram
|
Morfologi Sel
|
Penataan Sel
|
|
1
|
-
|
Basil
|
Streptococcus
|
|
2
|
-
|
Basil
|
Streptococcus
|
|
3
|
-
|
Basil
|
Streptococcus
|
|
4
|
+
|
Basil
|
Diplobasil
|
|
5
|
-
|
Basil
|
Streptococcus
|
Keterangan : + = bakteri berwarna ungu
- = bakteri berwarna merah
Gambar 1. Hasil Pewarnaan Gram pada Sample Tabung 1
Gambar 2. Hasil Pewarnaan Gram pada Sample Tabung 2
Gambar 3. Hasil Pewarnaa Gram pada Sample Tabung 3
Gambar 4. Hasil Pewarnaan Gram pada Sample Tabung 4
Gambar 5. Hasil Pewarnaan Gram pada Sample Tabung 5
Tabel 2. Hasil Pewarnaan Spora
|
Sample (Tabung)
|
Gram
|
Morfologi Sel
|
Penataan Sel
|
|
1
|
+
|
Basil
|
Streptococcus
|
|
2
|
+
|
Basil
|
Streptococcus
|
|
3
|
+
|
Basil
|
Streptococcus
|
|
4
|
+
|
Basil
|
Diplobasil
|
|
5
|
+
|
Basil
|
Streptococcus
|
Keterangan : + = membentuk spora dan berwarna hijau
Gambar 6. Hasil Pewarnaan Spora pada Sample Tabung 1
Gambar 7. Hasil Pewarnaan Spora pada Sample Tabung 2
Gambar 8. Hasil Pewarnaan Spora pada Sample Tabung 3
Gambar 9. Hasil Pewarnaan Spora pada Sample Tabung 4
Gambar 10. Hasil Pewarnaan Spora pada Sample Tabung 5
Pembahasan
Pewarnaan
gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negative,
tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal
violet. Contoh dari bakteri gram positif ialah Clostridium perfringens, Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri gram negative misalnya adalah Eschericia Coli. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan gram, misalnya Mycobacterium spp,
karena dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan
pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya. Pada pewarnaan tersebut
sel bakteri akan berwarna merah tetapi sel jaringan akan berwarna hijau (
James 2002).
Proses
sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri
sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik aseptik.
Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan meja,
bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu.
Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan
agar mendapatkan pengukuran yang akurat.
Sample
biakan bakteri berbentuk suspense homogen agar bakteri dapat menyebar
dan tidak menumpuk pada kaca preparat. Kemudian dikering udarakan atau
fiksasi udara agar bakteri menempel pada kaca preparat. Fiksasi panas
atau dikeringkan dengan pemanasan biasanya di atas spirtus pada
pewarnaan gram dapat menyebabkan bakteri tersuspensi mati atau tidak
produktif apabila suhu terlalu tinggi, walaupun dapat melekatkan bakteri
pada kaca preparat. Setelah itu biakan bakteri diteteskan Kristal ungu
yang berfungsi memberikan pewarnaan pada bakteri tersebut. Bakteri akan
berwarna ungu. Penetesan Kristal ungu harus merata pada seluruh area
biakan bakteri pada kaca preparat agar bakteri dapat terwarnai denga
sempurna. Bakteri yang telah diwarnai dikering udarakan selama satu
menit sambil digoyangkan. Lalu dibilas dengan aquades dengam cara
mengalirkannya, bukan dengan penyemprotan secara langsung pada bakteri
tersebut karena dapat menyebabkan bakteri rusak terkena semprotan
aquades. Bakteri dikering udarakan kembali. Setelah itu, ditambahkan KI
(Kalium Iodida) agar dapat menyatu dengan ungu Kristal yang membentuk
kompleks di dalam sel sehingga sel tetap berwarna ungu. Kemudian
dikering udarakan dan dibilas dengan aquades. Alkohol 96% ditambahkan
atau diteteskan pada biakan bakteri untuk melakukan penetrasi ke dalam
dinding sel dan melunturkan pewarnaan ungu dari komplek Kristal ungu dan
KI (UK-Y) pada gram negative, karena mengandung lipid sedangkan pada
gram positif akan tetap mempertahankan warna ungu karena mengandung
peptidoglikan. Bakteri gram positif akan mengalami dehidrasi pada
dinding selnya dan pori-porinya menciut karena daya rembes dinding sel
dan membrane menurun sehingga kompleks UK-Y tidak dapat keluar dari sel
dan tetap berwarna ungu. Sedangkan pada gram negative lipid tereksitasi
(keluar) dari dinding sel dan pori-pori mengembang sehingga kompleks
UK-Y keluar dari sel dan sel menjadi tidak berwarna atau warna ungu akan
luntur karena peluruhan dinding sel. Setelah dibilas, penambahan
safranin yang merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk
mewarnai gram negative yang semula telah luntur pewarnaannya menjadi
warna merah. Hasil akhinya adalah bakteri gram positif akan berwarna
ungu dan bakteri gram negative akan berwarna merah. Pengamatan gram
dapat dilakukan di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000x dan harus
menggunakan minyak imersi.
Data
dan hasil pengamatan menunjukkan bahwa tabung eppendorf berisi sample
1, 2, 3, dan 5 mengandung bakteri gram negative dengan morfologi sel
basil (batang) dan penataan sel streptococcus yaitu bentuk rantai bulat.
Sedangkan pada tabung 4 menghasilkan gram positif, morfologi sel batang
atau basil, dan penataan sel diplobasil yaitu berbentuk dua batang
berjejer. Seharusnya semua hasil pada berbagai tabung adalah gram
negative karena berasal dari suatu sampe yang sama maupun berbeda media.
Penyimpangan hasil pada tabung 4 dapat disebabkan oleh berbagai faktor,
misalnya pada saat melakukan fiksasi, fiksasi yang dilakukan adalah
fiksasi pemanasan dengan dipanaskan di atas spirtus, bukan dengan
fiksasi udara sehingga setelah dilakukan pewarnaan dengan ungu Kristal,
bakteri yang telah dipanaskan warna ungunya akan sangat melekat dengan
gelas objek atau kaca preparat dan akan sangat menyerap ke dalam dinding
sel. Saat pewarnaan selanjutnya dan dengan safranin yang sejharusnya
mencirikan gram negative berwarna merah, tidak dapat mengisi warna merah
pada dinding sel akibat alcohol yang juga tidak bisa meluruhkan dinding
sel (warna ungu) dikarenakan warna ungu sudah terlalu melekat pada
dinding sel akibat fiksasi pemanasan.
Spora
bakteri adalah bentuk bakteri yang sedang dalam usaha mengamankan diri
terhadap pengaruh buruk dari luar. Segera setelah keadaan luar baik bagi
mereka, maka pecahlah bungkus spora dan tumbuhlah bakteri. Spora juga
disebut endospora yang masih terletak didalam sel bakteri. Endospora
jauh lebih tahan terhadap pengaruh luar yang buruk daripada bakteri
biasa yaitu bakteri dalam bentuk vegetative, Sporulasi (proses
pembentukan spora) dapat dicegah apabila selalu diadakan pemindahan
biakan ke medium yang baru (Sudjadi 2006).
Pengecatan
endospora dengan larutan hijau malasit, bakteri penghasil endospora
akan menunjukkan reaksi positif yaitu larutan hijau malasit akan
berikatan dengan spora sehingga saat pencucian akan tetap berwarna hijau
dan cat penutup atau safranin tidak bisa diikat oleh endospora.
Sedangkan pada bakteri yang tidak menghasilkan endospora maka larutan
hijau malasit tidak dapat diikat (Pearce 2009).
Proses
pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi pemanasan agar bakteri
dapat sangat melekat pada kaca preparat dan membuat bakteri merasa
terancam sehingga membuat spora. Kemudian preparat diteteskan malasit
hijau secara merata yang berfungsi sebagai pewarnaan primer yang
digunakan untuk melumuri fiksasi panas dan dipanaskan sampai menggepul.
Preparat dipanaskan di atas spirtus yang bertujuan untuk membantu warna
menembus dinding endospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering.
Kemudian dicuci dengan aquades dengan cara mengalir dan dikering
udarakan bertujuan untuk menghilangkan malasit hijau dari seluruh bagian
sel endospora. Pewarnaan dengan safranin bertujuan sebagai counterstain
yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain daripada
endospora. Kemudian dibilas kembali denan aquades atau air mengalir agar
warna safranin luntur dan dikerigkan agar warna cepat kering dan
terlihat. Kemudian diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 1000x dan
memakai minyak imersi.
Data
dan hasil pengamatan menunjukkan bahwa semua bakteri dari seluruh
tabung dapat menghasilkan spora yang ditandai dengan terbentuknya warna
hijau akibat pewarnaan malasit green, dengan morfologi sel basil,
penataan sel streptococcus. Sedangkan tabung 4 hanya berbeda penataan
sel yaitu diplobasil mengikuti bentuk penataan sel bakteriya namun tetap
berwarna hijau. Spora yang terbentuk oleh bakteri mengindikasikan
bahwa bakteri telah terancam atau dalam keadaan berbahaya akibat
lingkungan yang tidak mendukung untuk mempertahanka keturunannya,
sehingga spora kan terbang dan mencari media baru serta berkembang biak.
Jamur
dan fungi tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan gram dan biasanya
diidentifikasi dengan pewarnaan jaringan yang terinfeksi untuk melihat
struktur tipikal. Kultur murni dapat diwarnai dengan metilen biru atau
malasit hijau untuk menunjukkan struktur reproduksinya (Firmansyah
2009).
Simpulan
Berdasarkan
data dan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa bakteri dari hasil
pewarnaan gram ialah gram negative yang berwarna merah, sedangkan pada
pewarnaan spora, bakteri dapat menghasilkan spora yang berwarna hijau.
Daftar Pustaka
Firmansyah Ricky. 2009. Mudah dan Aktif Belajar Biologi. Jakarta : Grafindo Media Pratama (halaman : 109)
James Joyce. 2002. Prinsip-Prinsip Sains Untuk Keperawatan. Retno Indah, penerjemah. Jakarta : Erlangga. Terjemahan dari : Principles of Science for Nurses (halaman : 115)
Karmana Oman. 2008. Biologi. Jakarta : PT Grafindo Media Pratama (halaman : 56)
Pearce Evelyn. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Yuliani Sri, penerjemah. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan dari : Anatomy and Physiology for Nurses (halaman : 200)
Sudjadi Bagod. 2006. Biologi Sains Dalam Kehidupan. Jakarta : Yudhistira Ghalia Indonesia (Halaman : 16)
No comments:
Post a Comment