LAPORAN PERHITUNGAN MIKROBA

Pendahuluan

Mikrobiologi adalah suatu cabang ilmu biologi yang mempelajari tentang mikroorganisme dan interaksi mereka dengan organisme lain dan lingkungannya. (Singleton.2006)

Sejarah tentang mikroba dimulai dengan ditemukannya mikroskop oleh Leeuwenhoek (1633-1723). Mikroskop temuan tersebut masih sangat sederhana,

dilengkapi satu lensa dengan jarak fokus yang sangat pendek, tetapi dapat menghasilkan bayangan jelas yang perbesarannya antara 50-300 kali. (Skou, dan Sogaard Jensen. 2007)

Mikroba ialah jasad renik yang mempunyai kemampuan sangat baik untuk bertahan hidup. Jasad tersebut dapat hidup hamper di semua tempat di permukaan bumi. Mikroba mampu beradaptasi dengan lingkungan yang sangat dingin hingga lingkungan yang relative panas, dari ligkungan yang asam hingga basa. Berdasarkan peranannya, mikroba dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu mikroba menguntungkan dan mikroba merugikan (Afriyanto 2005).

Penentuan jumlah angka mikroorganisme sangat penting dilakukan untuk menetapkan keamanan suatu sediaan farmasi dan makanan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk menghitung jumlah mikroorganisme. Metode tersebut menghitung jumlah sel, massa sel, atau isi sel yang sesuai dengan jumlah sel. Terdapat empat macam cara umum untuk memperkirakan besar populasi mikroorganisme, yaitu perhitungan langsung, pengukuran langsung, perhitungan tidak langsung dan perkiraan tidak langsung (Harmita 2006).

Perhitungan langsung (direct count) untuk jumlah sel atau biomassa mikroorganisme dan sel dihitung langsung di bawah mikroskop atau dengan perhitungan partikel elektronik (electronic particle counter). Pengukuran langsung (direct measurement) untuk biomassa mikroorganisme, massa sel dapat ditentukan dengan menimbang atau mengukur berat seluruh sel, dan biomassa dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dengan membandingkan pada kurva standar. Perhitungan tidak langsung (indirect count) untuk jumlah sel, mikroorganisme dalam sampel dikonsentrasikan dan ditanam pada media yang sesuai, pertumbuhan mikroorganisme contohnya pembentukan koloni dalam pelat agar, digunakan untuk memperkirakan jumlah mikroorganisme yang terdapat di dalam sampel. Perkiraan tidak langsung (indirect estimate) untuk biomassa mikroorganisme, biomassa mikroorganisme diperkirakan  dengan mengukur komponen biokimia sel mikroorganisme yang relative konstan, seperti protein, adenosine trifosfat (ATP), lipopolisakarida (LPS), murein dan klorofil. Biomassa juga dapat diperkirakan secara tidak langsung dengan mengukur kekeruhan. Perkiraan tidak langsung biomassa mikroorganisme dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dengan membandingkan dengan kurva standar (Harmita 2006).

Tujuan

Praktikum bertujuan menentukan jumlah khamir dalam media dengan perhitungan langsung.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan ialah Haemocytometer Neubour, mikroskop, alat bantu menghitung mikroorganisme dan mikropipet.

Bahan-bahan yang digunakan ialah alcohol 70% dan suspensi bakteri/khamir/yeast/ragi/saccharomyses

Prosedur

Suasana steril harus diciptakan dari awal praktikum hingga akhir praktikum. Terlebih dahulu, tangan dicuci dengan sabun dan dibilas dengan air hingga bersih. Tangan dikeringkan dan kemudian tangan dan meja dibasahi dengan alcohol 70% hingga tangan dan area kerja  steril serta kering. Haemocytometer Neubour dibasahi pula dengan alcohol 70% hingga Haemocytometer Neubour tersebut steril. Mikroskop dihidupkan dan diatur  cahayanya, jangan terlalu terang dan jangan terlalu gelap. Haemocytometer Neubour diletakkan di atas meja objektif. Lalu kamar-kamarnya dicari dan diamati di bawah mikroskop dengan menggunakan perbesaran mikoskop 4x10. Jika kamarnya telah ditemukan, khamir diletakkan di atas Haemocytometer Neubour dengan mikropipet dengan volume tertentu. Kemudian khamir diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran yang lebih besar agar lebih jelas terlihat. Jumlah khamir yang berada di kotak kecil di dalam kamar kaca dihitung dengan menggunakan bantuan alat penghitung. Perhitungan dilakukan secara diagonal. Setelah dihitung, jumlah khamir dicatat dan perhitungan dilakukan.

Data dan Hasil Pengamatan

18				30
	25		31
		30
	35		28
22				55

Perhitungan :

Jumlah sel/ml  = 18+25+30+28+55+22+35+30+31+30  x 25 x  1  x 10³

                                                10                                                  0,1

                        =  7,725 x 10⁶ sel/ml

Pembahasan

Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium. Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang akurat. Setelah itu, Haemocytometer Neubour dibasahi dengan alcohol 70% untuk membersihkan alat tersebut dari kotoran maupun mikroorganisme, karena pada saat diamati di bawah mikroskop alat harus bersih dan steril agar pengamatan terlihat jelas oleh mata dan mempermudah perhitungan mikroba.

Tersedia banyak teknik di dalam laboratorium untuk mengukur pertumbuhan mikroba . Alat-alat yang ada tersebut berkisar dari peralatan yang masih sederhana seperti sebuah kaca objek dengan olesan yang diwarnai. Selain itu, terdapat pula metode-metode yang lain dalam pengukuran pertumbuhan mikroba, misalnya dengan metode hitung cawan, pengukuran kekeruhan dari suatu suspensi, pengukuran dengan menggunakan membran atau filter molecular dan penentuan berat. Suatu bakteri juga dapat dihitung secara elektronik yaitu dengan cara memasukkan biakan melalui lubang yang sangat kecil pada alat penghitung partikel counter. Alat penghitung tersebut dapat dipakai secara rutin untuk memecah sel darah, namun dapat pula disesuaikan untuk memecah bakteri (Volk 1993).

Penentuan jumlah bakteri yang ada dalam suatu medium maka dapat digunakan beberapa cara meliputi jumlah bakteri secara keseluruhan (total cell count). Pada cara tersebut dihitung semua bakteri yang ada dalm suatu medium biakan baik yang hidup maupun yang mati. Jumlah bakteri yang hidup (viable count). Cara tersebut menggambarkan jumlah sel yang hidup saja, sehingga lebih tepat jika dibandingkan dengan cara sebelumnya. Namun metode hitung langsung menggunakan Haemocytometer Neubour menggunakan cara total cell count (Lay 1994)

Haemocytometer Neubour atau Hemositometer ialah perangkat atau alat yang berfungsi untuk perhitungan sel darah. Saat ini juga banyak digunakan untuk menghitung jumlah sel serta partikel mikroskopis lainnya. Haemocytometer tersebut ditemukan oleh Louis-Charles Malassez dan terdiri dari sebuah slide mikroskop kaca tebal dengan lekukan persegi panjang yang menciptakan sebuah kamar. Ruangan atau kamar tersebut diukir dengan laser grid tergores garis tegak lurus. Perangkat tersebut dibuat dengan hati-hati sehingga daerah yang dibatasi oleh garis diketahui dan kedalaman ruang tersebut telah diketahui. Oleh karena itu, alat tersebut berguna untuk menghitung jumlah sel atau partikel dalam suatu volume cairan tertentu, sehingga dapat menghitung konsentrasi sel dalam cairan secara keseluruhan (Kurniawan 2010).

Haemocytometer Neubour sering digunakan untuk menghitung sel-sel darah, organel dalam sel, sel-sel darah dalam cairan tulang punggung ke otak setelah melakukan tusukan lumbal, atau jenis sel lain di suspense (Kurniawan 2010).

Setelah Haemocytometer Neubour dibersihkan dengan alcohol dan setelah mikroskop dihidupkan, Haemocytometer Neubour diletakkan di atas meja objectif. Kemudian mikroskop di atur dengan intensitas cahaya yang rendah atau redup sehingga garis-garis yang terletak pada kamar Haemocytometer Neubour dapat terlihat jelas. Apabila cahaya mikroskop terlalu terang, maka garis-garis pada Haemocytometer Neubour yang tipis sekali tidak akan terluhat karena dikalahkan oleh sinar yang lebih besar. Selain cahaya, faktor perbesaran mikroskop juga berpengaruh. Kamar Haemocytometer Neubour baik di bagian bawah maupun atas akn terlihat dalam perbesaran 4x10 dan pada percobaan terlihat jelas kamar bagian atas. Pada pebesaran tersebut, akan terlihat kotak-kotak berukuran besar sebanyak 25 kotak. Setiap satu kotak besar berukuran 1 mm².

Mikroorganisme yang dihitung oleh Haemocytometer Neubour ialah khamir. Khamir ialah organism eukariota, uniselular, heterotrof yang termasuk dalam kingdom Eumycota dan keberadaannnya tersebar pada berbagai habitat. Salah satu habitat khamir adalah perairan. Khamir dapat ditemukan pada perairan tawar, perairan mangrove maupun perairan laut (Retno 2009).

Setelah itu, khamir akan diteteskan pada kamar bagian atas Haemocytometer Neubour dengan volume tertentu menggunakan mikropipet, namun sebelumnya khamir telah ditambahkan Na₂EDTA untuk anti gumpal sehingga dapat mempermudah perhitungan. Lalu ditutup bagian kamar yang sudah diletakkan khamir dengan kaca tipis. Perbesaran 40 kali pada mikroskop akan menghasilkan gambar yang buram, sehingga diperlukan perbesaran yang lebih yaitu 10x10. Perbesaran 100 kali, tentu akan menghasilkan gambar yang terlihat jelas terutama pada bagian kamar Haemocytometer Neubour. Gambar yang terlihat jelas tersebut didapatkan dengan mengatur kenop mikro yang ada pada bagian samping mikroskop sehingga gambar terlihat focus dan tentu dengan bantuan cahaya yang sedikit redup. Satu kotak besar yang menyusun kamar, terdapat 16 kotak kecil didalamnya sehingga kotak kecil dalam kamar berjumlah 400 buah. Setelah khamir yang berhamburan pada kamar Haemocytometer Neubour terlihat jelas, maka dilakukan perhitungan dengan menggunakan alat bantu perhitungan jumlah mikroorganisme yang sedang diamati di bawah mikroskop. Khamir akan memecah dan membentuk sel atau bulatan-bulatn kecil yang memisah satu sama lain. Lalu ada juga yang bergabung dari dua sampai tiga sel menjadi satu sel saja membentuk koloni, namun jika koloni tersebut masih terlihat gabungan beberapa sel, koloni tersebut tetap dihitung tiga sel, bukan satu sel. Perhitungan pun juga berdasarkan bentuk X pada kamar atu diagonal kanan dan diagonal kiri. Perhitungan hanya dilakukan pada diagonal tersebut saja.

Perhitungan mendapatkan hasil diagonal kanan dari atas ke bawah berturut-turut terdapat khamir sebanyak 18, 25, 30, 22 dan 55, sedangkan untuk diagonak kiri dari atas ke bawah berturut-turut terdapat khamir sebanyak 30, 31, 30, 35 dan 27. Perhitungan dilakukan denga rumus seperti perhitungan pada data dan hasil pengamatan, yaitu

Jumlah sel/ml  =   jumlah sel   x 25 x  1  x 10³

                                    n                      0,1

Jumlah sel yang telah dihitung dalam percobaan ialah 309 sel. Sedangkan n adalah banyaknya sl yaitu 10. 25 yaitu jumlah kotak besar yang ada di kamar Haemocytometer Neubour. 10³ ialah konversi dari 1 liter menjadi 1000 ml atau 10³ mililiter. Setelah melakukan perhitungan, terdapat 7,725 x 10⁶ sel/ml sel khamir pada kamar bagian atas Haemocytometer Neubour secara diagonal kanan dan diagonal kiri. Jumlah tersebut menunjukkan terdapat tujuh juta lebih khamir yang terdapat dalam kamar Haemocytometer Neubour yang sangat kecil tersebut.

Haemocytometer Neubour memiliki kelemahan dan kelebihan dalam penggunaannya dalam proses perhitungan bakteri secara langsug. Kelebihannnya antara lain ialah cepat dalam menghasilkan data dan tak perlu menunggu lama, serta datanya atau jumlah selnya langsung didapat pada saat itu juga setelah menghitung menggunakan rumusnya dan menghemat biaya. Sedangkan kelemahannya ialah tidak dapat membedakan antara sel yang mati dengan yang hidup karena perhitungannya secara keseluruhan dan data yang dihasilkan tidak akurat karena setiap pengamat memiliki mata yang berbeda-beda dan terdapat keterbatasan dalam melihat serta menghitung sel yang ada dalam kamar Haemocytometer Neubour. Sebaiknya menggunakan alat yang lebih canggih lagi dalam perhitungan jumlah sel karena setiap peralatan elektronik memilki kesensitifan yang tinggi dibandingkan dengan mata manusia, seperti lat particle count.

Simpulan

Berdasarkan data dan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa praktikan dapat megetahui cara perhitungan mikroba secara langsung. Terdapat 7,725 x 10⁶ sel/ml sel khamir yag terdapat di kamar Haemocytometer Neubour secara diagonal kanan dan diagonal kiri.

Daftar Pustaka                                       

Afriyanto Eddy. 2005. Pakan Ikan dan Perkembangannya. Jakarta : Penerbit Kanisius (halaman : 140)

Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Hayati Edisi Ketiga. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC (halaman : 125)

Kurniawan Sodikin . 2010, Haemocytometer. [terhubung berkala]. http://www.sodiycxacun.web.id/2010/08/haemocytometer.html#axzz1ZS1O7adR. [29 September 2011 : 16 :50]

Lay B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Raja Grafindo Persada.

Retno Anisa. 2009. Identifikasi Khamir. [terhubung berkala]. www.lontar.ui.ac.id/file?file=digital/...003...Identifikasi%20khamir.pdf [29 September 2011, 17 : 29]

Singleton Paul.2006. Dictionary of Microbiology And Molecular Biology Third Edition. England : John wiley & Sons Inc. (halaman : 475)

Skou Torben dan Sogaard Jensen Gunnar. 2007. Microbiologi. Englang : Forfattern Og Systime. (halaman : 8)

Volk. 1993. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Erlangga.