PEMBUATAN ASAM SITRAT DARI ASPERGILLUS NIGER

I. TUJUAN

Diharapkan agar mahasiswa dapat mengetahui bahwa Aspergillus niger L-51 dapat  memproduksi asam sitrat.

II. PERINCIAN KERJA

-          Peremajaan

-          Membuat media inokulum

-          Membuat media produksi

-          Pemisahan hasil

III. ALAT DAN BAHAN

      a. Alat

-          Gelas kimia

-          Erlenmeyer

-          Pengaduk

-          Hot plate

-          Spatula

-          Labu semprot

-          Corong

-          Autoklaf

-          Shaker incubator

-          Neraca analitik

-          Tutup Erlenmeyer

-          Alumunium foil

-          pH meter

       b. Bahan

-          Toge

-          Glukosa

-          KH₂PO₄

-          NH₄NO₃

-          FeSO₄.7H₂O

-          Pepton

-          Aquadest

-          Ca(OH)₂

-          Kultur murni Aspergillus niger L-51

IV. DASAR TEORI

Asam sitrat adalah suatu asam trikarboksilat, digunakan dalam industri farmasi, makanan dan minuman sebagai “acidifying and flavour agent”. Asam ditrat diproduksi dari beet dan molase dengan cara fermentasi menggunakan Aspergillus niger L – 51.

Produksi asam sitrat yang menggunakan bahan baku jeruk dan sebagainya, sejak berkembangnya proses fermentasi dari larutan yang mengandung karbohidrat (gula), secara berangsur-angsur mulai berkurang.

Wehmwr (1983) menguraikan cara produksi asam sitrat dengan fermentasi oleh sejenis fungi, yang disebut Citromyces dan selanjutnya dilaporkan bahwa Penicillum dan Mucor pun dapat menghasilkan produk tersebut. Tahun 1917 Curle menegaskan bahwa strain-strain dari Aspergillus niger merupakan fungi yang paling baik untuk digunakan dalam produksi asam sitrat.

Mikroba yang dapat menghasilkan asam sitrat cukup banyak. Diantar mikroba tersebut adalah Aspergillus niger, A. wentii, A. ciavatus, Penicillum luteum, P. citrinum, Mucor priformis, Paeocilomyces dicaricatum, Citromeaces prefferianus, Candida guillermondii, Sacharaecopsis lipolytica, Trichoderma viride, Arthroacter paraffimeaus dan Corynebacterium sp. Diantar mikroba tersebut yang dipakai untuk produksi asam sitrat adalah Aspergillus niger dan A. wentii yang merupakan  galur yang paling produktif.

Dalam memilih suatu species mikroba perlu dipertimbangkan suatu kenyataan bahwa suatu galur mikroba seringkali dikembangkan berdasarkan jenis sumber karbonnya. Suatu galur yang memberikan hasil optimum pada media yang mengandung sumber karbon tertentu, umumnya akan menurunkan produktivitas bila ditumbuhkan pada media yang mengandung sumber karbon lain.

Asam sitrat biasanya diproduksi dalam bentuk kristal monohidrat (C₆H₈O₇.H₂O), yang tak berwarna, tak berbau dan rasanya asam. Mudah larut dalam air dingin daripada dalam air panas.

Proses fermentasinya:

Larutan gula dari berbagai sumber telah digunakan sebagai bahan baku untuk pembuatan asam sitrat dalam skala industri, tetapi sukrosa dan glukosa tetap merupakan bahan baku yang paling mudaj dan paling baik kemudian diikuti oleh maltosa dan molase (tetes).

Mekanisme pembentukan asam sitrat seperti dinyatakan dengan siklus Krebs atau siklus asam trikarboksilat, yaitu bahwa asam piruvat yang diperoleh dari glukosa menghasilkan Acetil CoA yang berkondensasi dengan asam oxalo-asetat yang telah terbentuk dalam siklus menghasilkan asam sitrat.

Asam sitrat merupakan senyawa antara pada siklus krebs. Lintasan reaksi karbolik yang mendahului pembentukan asam sitrat ini diantaranya adalah lintasan glikolisis (Embden-Meyerhoff parnas) dan lintasan Entner Doudoroff yang menyediakan senyawa antara asam piruvat yang merupakan senyawa kunci dalam metabolisme sel. Sebagian besar (80%) dari glukosa diubah menjadi piruvat melalui lintasan glikolisis. Piruvat akan mengalami dekarboksilasi dan berkaitan dengan koenzim A membentuk asetil KoA dan selanjutnya masuk ke dalam siklus krebs dengan bantuan enzim piruvat karboksilase yang mengubah piruvat menjadi oksaloasetat.

Pada Aspergillus niger fosfoenol piruvat dapat diubah langsung menjadi oksaloasetat (tanpa melalui piruvat) oleh enzim fosfenol piruvat karboksilase. Reaksi tersebut membutuhkan ATP sebagai sumber energi, Mg²⁺ atau Mn²⁺ dan K⁺ atau NH⁴⁺.

Apabila sumber karbon bukan glukosa, tapi misalnya asam asetat atau senyawa alifatik berantai panjang (C-9, C-23), maka isositrat liase terinduksi sehingga siositrat diubah menjadi malat oleh malat oleh malat sintesa. Rangkaian reaksi melalui glioksilat. Bila glukosa ditambahkan glukosa, siklus tersebut terhambat.

Diduga bahwa terjadinya akumulasi asam sitrat ini adalah sebagai akibat dari adanya kekurangan enzim disebabkan kurangnya unsure-unsur nutrisi. Kekurangan-kekurangan nitrogen, fosfat, mangan, besi dan seng adalah unsure-unsur yang sering disebut-sebut.

Apabila kadar logamnya tinggi, maka untuk mengurainya biasanya tetesnya mengalami pengolahan pendahuluan terlebih dahulu, yaitu dengan penambahan Kalium ferrosianida atau dengan cara pertukaran ion.

Media untuk produksi asam sitrat harus menyediakan semua kebutuhan zat gizi mikroba, yaitu meliputi sumber karbon, nitrogen dan mineral.

a. Sumber karbon

Berbagai hasil pertanian, atau limbah pengolahan hasil pertanian dapat digunakan sebagai sumber karbon diantaranya adalah umbi-umbian (misalnya ubi kayu, talas dan singkong) sirup glukosa yang berasal dari pati yang dihidrolisa dengan asam, sukrosa, molase (bai dari gula maupun bit), onggok, dedak padi atau gandum, limbah pengolahan kopi dan limbah pengolahan nenas.

b. Sumber nitrogen dan mineral

Untuk proses fermentasi dibutuhkan sejumlah senyawa sumber nitrogen dan mineral (baik mineral makro maupun mikro). Biasanya, mineral mikro (tembaga, mangan, magnesium,besi,seng dan molybdenum) tidak perlu ditambahkan, karena pada bahan baku sumber karbon yang dipakai untuk produksi secara komersial, mineral tersebut sudah terdapat dalam jumlah yang banyak. Justru kadang-kadang perlu dilakukan perlakuan pendahuluan untuk mengurangi kandungan atau pengaruh mineral mikro yang bersifat toksik terhadap mikroba. Misalnya pada penambahan tembaga, asam sitrat tidak akan diproduksi. Penambahn tembaga berkoreasi positif dengan produksi asam sitrat.

Metode fermentasi

a. Pembuatan inokulum dan starter

Untuk fermentasi media padat dan fermentasi dangkal dibutuhkn inokulum berupa suspensi spora. Inokulum ini dibiakkan pada substrat padat suhu 25⁰C dengan masa inkubasi 10 – 14 hari pada kondisi aerobic.

b. Proses fermentasi

Proses fermentasi dapat dilakukan dengan fermentasi kultur terendam atau fermentasi kultur permukaan. Fermentasi kultur terendam terbagi dua yaitu dilakukan pada fermentor berpengaduk (stirrer pengaduk) dan pada air lift fermentor. Sedangkan fermentasi kultur permukaan dapat dilakukan dengan menggunakan media cair maupun media padat.

1. Fermentasi permukaan pada media padat

Fermentasi ini menggunakan media padat dari limbah pengolahan hasil pertanian, seperti onggok, dedak padi, dedak gandum, pulp tebu dan limbah pengolahan nenas. Pada fermentasi ini, mikroba kurang sensitife terhadap tingginya konsentrasi mineral mikro.

2. Fermentasi permukaan pada media cair

Fermentasi ini menggunakan media cair pada wadah dangkal (tidak terlalu dalam) sehingga memperluas bidang kontak antara media dengan oksigen di udara.

3. Fermentasi kultur terendam

Saat ini sebagian besar (80%) produksi asam sitrat berasal dari fermentasi kultur terndam. Fermentasi ini menggunakan paralatan yang lebih canggih dengan kebutuhan energi yang lebih banyak, tapi lebih sedikit memerlukan lahan dan tenaga kerja.

Produksi menurut kultur permukaan

Pemilihan media fermentasi yang tepat adalh factor yang paling kritis dalam produksi asam sitrat. Dalam hal ini diperlukan defisiensi nutrsional logam-logam dan fosfat. Meskipun ini harus sedikit defisien dalam unsure fosfat atau satu atau lebih unsure logamnya, yakni mangan, besi, seng dan mungkin tembaga.

Beberapa factor sangat menetukan persiapan media. Faktor-faktor tersebut adalah kandungan gula, garam organic, pH, nisbah luas permukaan terhadap volume, ketersediaan oksigen dan suhu media.

1)      Kandungan gula

Umumnya konsentrasi gula yang tinggi diperlukan untuk mendapatkan hasil yang banyak. Larutan dengan konsentrasi 14-20 % dapat dipergunakan. Substitusi parsial terhadap sukrosa dan fruktosa atau glukosa, yang menghasilkan konsentrasi gula 1-5 % (diluar total 14 %) akan menghasilkan asam sitrat yang lebih sedkkit bila dibandingkan dengan media yang hanya mengandung sukrosa. Hidrolisa parsial selama sterilisasi juga menurunkan hasil asam sitrat.

2)      Garam-garam anorganik

Selain karbon, hydrogen dan oksigen yang berasal dari karbohidrat diperlukan juga nitrogen, kalium, fosfor, belerang dan magnesium untuk media fermentasi.

3)      Keasaman (pH)

Kemantapan pH adalah factor yang terpenting dalam proses fermentasi. Garam-garam anorganik dan pH sangat berpengaruh terhadap prporsi asm sitrat dan oksalat yang dihasilkan. Jadi pH dan garam anorganik harus demikian hingga produksi asam sitrat tinggi dan sebaliknya asam oksalat ditekan serendah mungkin.

Penggunaan pH rendah banyak menguntungkan yakni hasil asam sitrat yang tinggi, pembentukan asam oksalat tertekan dan bahaya kontaminasi minimum.

4)      Nisbah luas permukaan terhadap volume media

Dalam fermentasi asam sitrat konversi gula menjadi asam sitrat dilakukan oleh enzim-enzim intrasel dan berlangsung dalam sel yang membentuk suatu lapisan miselium. Gula masuk ke dalam sel-sel secara osmosis, sedangkan asam keluar dengan cara difusi. Laju awal proses enzimatik dan difusi akan menentukan beberapa lama fermentasi berlangsung.

5)      Suplai oksigen

Suplai oksigen (melalui udara) yang terlalu banyak justru akan menurunkan rendemen. Kadang-kadang justru rendemen akhir fermentasi dengan suplai udara khusus sama saja dengan rendemen akhir fermentasi tanpa suplai udara. Tetapi suplai udara yang terlalu sedikit juga berakibat tidak baik terhadap asam sitrat.

6)      Suhu

Suhu yang tepat tergantung pada organisme dan kondisi fermentasi. Biasanya fermentasi dilakukan pada suhu 25 – 35 ⁰C. Doelgar dan Prescott menegaskan bahwa 26 - 28 ⁰ C adalah suhu yang paling optimum. Mereka menyatakan bahwa jumlah asam sitrat yang dihasilkan akan meningkat seiring dengan peningkatan suhu dari 8 – 28 ⁰C. Diatas 30 ⁰C produksi asam sitrat akan menurun dan produksi asam oksalat justru akan meningkat. Aspergillus niger pada suhu inkubasi menghasilkan kalsium sitrat sebanyak 25 – 30 gram dari 200 gram molase yang mengalami dua hari fermentasi. selain itu juga dihasilkan kalsium glukonat.

V. PROSEDUR KERJA

    Peremajaan

-           Menimbang glukosa 2 gram dan agar 1,5 – 2 gram.

-           Menimbang toge sebanyak 10 gram dan dimasak dalam 100 ml air sampai mendidih. Kemudian ditambahkan glukosa dan agar dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi.

-           Sterilkan selama 15 -  20 menit pada tekanan 20 psi 121⁰C. Diamkan dan miringkan sampai membeku.

-           Media agar miring tersebut kemudian digunakan untuk meremajakan kultur murni Aspergillus niger L – 51. Kemudian di inkubasikan selama 2 x 24 jam.

    Membuat media inokulum

-           Membuat ekstrak toge dengan menggunakan 10 gram toge yang dimasak dengan 100 ml air.

-           Menimbang 5 g glukosa, 0,1 g KH₂PO₄, 0,5 g NH₄NO₃, 0,3 pepton dan 0,001 g FeSO₄.7H₂O. Kemudian dilarutkan dalam ekstrak toge dan usahakan agar pH larutan 6.

-           Larutan tersebut dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan ditutup dengan kapas dan alumunium foil dan sterilkan.

-           Masukkan hasil peremajaan (kultur murni Aspergillus niger L – 51) kedalam Erlenmeyer tersebut dan di shaker selama 2 x 24 jam dalam shaker incubator.

    Membuat media produksi

-           Membuat ekstrak toge dengan menggunakan 10 gram toge yang dimasak dengan 100 ml air.

-           Menimbang 10 g glukosa, 0,1 g KH₂PO₄, 0,5 g NH₄NO₃, 0,3 pepton dan 0,001 g FeSO₄.7H₂O. Kemudian dilarutkan dalam ekstrak toge dan usahakan agar pH larutan 6.

-           Larutan tersebut dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan ditutup dengan kapas dan alumunium foil dan disterilkan.

-           Dengan menggunakan gelas ukur yang telah disterilkan, media inokulum dipipet sebanyak 5 ml kemudian dimasukkan ke dalam media produksi. Shaker selama 144 jam dalam shaker incubator.

    Pemisahan hasil

-           Setelah di shaker kemudian disaring dengan kertas saring wheatman 41 dan diukur pH nya dengan menambahkan Ca(OH)₂ sampai pH 5,8..

-           Diamkan selama beberapa hari (jika terbentu endapan putih berarti mengandung sitrat).

VI. DATA PENGAMATAN

a. Membuat media inokulum

Setelah di shaker selama 48 jam, terdapat bulatan-bulatan kecil berwarna putih.

b. Membuat media produksi

Setelah di shaker selama 144 jam pada dinding Erlenmeyer terdapat kapang  yang berwarna kehitaman.

c. Pemisahan hasil

Setelah penambahan Ca(OH)₂ terdapat endapan putih.

VII. PEMBAHASAN

Pada percobaan produksi asam sitrat digunakan Aspergillus niger L-51 yang berfungsi sebagai biokatalisator  dimulai dengan membuat media inokulum dengan menggunakan glukosa, KH₂PO₄, NH₄NO₃, pepton dan FeSO₄.7H₂O. Setelah di shaker selama 48 jam terdapat bulatan-bulatan kecil atau miselium yang berwarna putih. Kemudian media inokulum tersebut dimasukkan ke dalam media produksi. Usahakan miselium tersebut juga dimasukkan ke dalam media produksi. Kemudian  dishaker selama 144 jam. Pada dinding erlenmeyer terdapat kapang yang berwarna kehitaman. Hasil fermentasi tersebut disaring dengan kertas wheatman 41 dan ditambahkan Ca(OH)₂ sehingga terbentuk endapan putih. Hal ini menandakan bahwa terdapat asam sitrat.

As. sitrat + Ca(OH)₂                                   Ca sitrat       

                                                                                              putih

Aspergillus niger L-51 merupakan organisme aerob karena pada proses fermentasi erlenmeyer hanya ditutup dengan kapas sehingga memudahkan suplai udara terhadap bakteri tersebut. Pada percobaan ini kami terlambat membuka penutup alumunium foilnya sehingga miselium yang diperoleh tidak terlalu banyak.

VIII. KESIMPULAN

Dari percobaan produksi asam sitrat dapat disimpulkan bahwa asam sitrat dapat diproduksi dari Aspergillus niger L–51 dengan melalui beberapa tahap yaitu membuat media inokulum, media fermentasi dan pemisaha hasil. Dimana terbentuknya asam sitrat dapat diketahui dengan adanya endapan putih setelah penambahan Ca(OH)₂.