LAPORAN STERLISASI AUTOKLAF BIOPROSES 1

Dasar Teori.
Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan maupun organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap (Sany 2007: 1).

   Adapun prinsip-prinsip dalam kultur jaringan sendiri kita ketahui antara lain (1). Totipotensi Sel: Setiap sel dari manapun asalnya, akan mampu tumbuh menjadi tanaman sempurna kalau diletakkan pada lingkungan yang sesuai (Scheleiden & Sachwan, 1901), (2). Regenerasi Tanaman: Proses menuju diferensiasi ke arah pembentukan organ baru, (3). Bebas Kontaminasi Mikroorganisme, dan (4). Lingkungan (media) yang sesuai dengan pertumbuhan jaringan. Dapat dilihat salah satu prinsip adalah terbebas dari kontaminasi mikroorganisme. Ini artinya kultur jaringan merupakan perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman, menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. Lingkungan yang sesuai dapat dipenuhi dengan menentukan media tumbuh yang sesuai dan penempatan pada kondisi yang terkendali berkaitan dengan intensitas dan periodisitas, cahaya, temperatur, dan kelembaban serta keharusan sterilisasi  (Hendaryono & Wijayani 1994: 2).

    Sterilisasi merupakan hal yang erat dengan pembuatan medium isolasi dan pembiakan mikroorganisme secara murni. Pengertian umum sterilisisasi adalah suatu proses yang berusaha membebaskan bahan atau alat dari mikroorganisme. Namun perlu diketahui bahwa bahan atau alat yang telah melalui proses sterilisasi tidak akan benar-benar bebas dari mikroorganisme. Tujuan utama sterilisasi adalah untuk meminimalkan gangguan oleh mikroorganisme yang tidak dikehendaki (kontaminan), sekaligus meminimalkan gangguan akibat proses sterilisasi itu sendiri sekecil mungkin (Sany 2007: 1).

    Sterilisasi dalam segala kegiatan kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan.  Teknisi yang melakukan kultur jaringan pun juga harus dalam keadaan steril. Tidak hanya terbatas pada peralatan, namun ruangan yang akan digunakan pun harus dalam kondisi aseptik. Tujuan utama dari sterilisasi ruangan maupun peralatan kultur pada dasarnya untuk menghindari kontaminasi oleh mikro organisme yang ada di peralatan maupun di udara bebas sekitar ruangan. Perlakuan tersebut mutlak dilakukan terutama pada ruang penabur atau tempat yang digunakan untuk penanaman eksplan (Fardiaz 1992: 2).

         Faktor-faktor yang perlu diperhatikan untuk keberhasilan kultur jaringan yaitu bahan sterilisasinya, kandungan unsur kimia dalam media, hormon yang digunakan, substansi organik yang ditambahkan dan terang atau gelapnya saat inkubasi. Dari sekian banyak permasalahan yang harus diteliti dan diperhatikan adalah komposisi media tumbuh pada kultur jaringan karena sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya. Teknik aseptik merupakan salah satu kunci keberhasilan dalam kutur jaringan. Keaseptikan harus dijaga dalam proses pengkulturan, selain itu juga termasuk sterilisasi bahan tanaman (eksplan). Pada tahap ini dilakukan berbagai perlakuan untuk membersihkan kotoran yang ada di permukaan bahan tanaman (disinfestasi). Selain itu, zat pengatur tumbuh adalah senyawa organik bukan hara yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi tanaman (Daisy 1994: 4).

1.2. Tujuan

         Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari cara serta prinsip-prinsip sterilisasi alat dan bahan dalam teknik kultur jaringan tumbuhan.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Sterilisasi merupakan  suatu proses  untuk  mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja  yang dapat tembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu yang berkisar antara 110-121 . Sterilisasi dalam setiap proses baik fisika, kimia dan mekanik yang membunuh semua bentuk kehidupan terutama mikroorganisme atau usaha untuk membebaskan alat dan bahan dari segala bentuk kehidupan terutama mikrobia (Fardiaz 1992: 4).

Menurut Hamdan (2012: 11), bahwa sterilisasi dalam setiap proses yang umum dilakukan dapat berupa: (a). Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan  selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat “bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170–180  dan waktu yang digunakan 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas), (b). Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin), (c).  Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba).

Autoclaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan medium kultur jaringan tumbuhan denan mengunakan tekanan 15 psi (1,02 atm) dan suhu 121°C . Sterilisasi dengan autoklaf adalah salah satu metode sterilisasi dengan uap air di bawah tekanan. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media kultur jarinan tumbuhan yang disterilkan memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibandingkan dengan udara panas. Biasanya untuk mensterilkan media diunakan suhu 121°C dan tekanan 15 lb/in² (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit (Torres 1989: 1).

Menurut Yuan (2012: 2), bahwa dalam metode kultur jaringan diperlukan lingkungan yang steril. Ada beberapa metode sterilisasi alat dan bahan tanaman. Sterilisasi dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu dengan pembakaran, pemanasan kering, pemanasan basah, penyaringan atau secara kimiawi. Sterilisasi dengan pembakaran yaitu alat-alat yang terbuat dari logam dapat disterilkan dengan cara memanaskan atau membakar di atas lampu spirtus. Sterilisasi dengan udara panas/kering pada alat-alat dari gelas seperti cawan petri, erlenmeyer, tabung piala, botol eksplan, tabung reaksi dan sebagainya dapat disterilkan dengan udara panas (oven) pada suhu 130 – 160^o C selama 1 – 2 jam. Alat-alat ditata tidak terlalu rapat agar sirkulasi udara antar tumpukan alat dapat berjalan lancar, sehingga semua alat dapat disterilkan dan dapat dengan mudah dijaga kesterilannya saat dikeluarkan dari alat sterilisasi.

Sterilisasi dengan uap panas (basah) pada bahan atau alat dapat disterilkan dengan uap panas atau secara basah pada uap panas biasa atau uap panas dengan tekanan tinggi, secara terus menerus (kontinyu) atau secara terputus putus (diskontinyu), khususnya medium pada suhu atau tekanan yang rendah. Untuk sterilisasi dengan cara ini sering kali menggunakan otoklaf. Sterilisasi medium biasanya dilakukan pada suhu 121^oC dengan tekanan 1 atm selama 15-30 menit, namun untuk medium yang tidak mudah rusak dapat dilakukan pada suhu atau tekanan yang sedikit lebih tinggi. Sterilisasi dengan bahan kimia yaitu bahan kimia tertentu sering digunakan untuk sterilisasi alat maupun bahan. Etanol 70% sering digunakan untuk sterilisasi permukaan pada alat yang sering dikombinasi dengan pembakaran pada api. NOCl (natrium hipoklorit) dan formalin juga sering digunakan untuk sterilisasi permukaan atau disinfestasi permukaan atau disinfeksi permukaan (Torres 1989: 1).

Suatu alat atau bahan dikatakan steril apabila alat atau bahan  tersebut bebas dari mikrobia, baik dalam bentuk vegetative ataupun spora. Suatu benda atau substansi hanya dapat dikatakan steril atau tidak steril, tidak  akan pernah mungkin ada setengah steril atau hampir steril. Untuk sterilisasi alat dan medium digunakan sterilisasi dengan mengunakan alat yang disebut autoclave. Sterilisasi dilakukan untuk membunuh bakteri dan cendawan yang melekat pada eksplan maupun pada alat serta bahan yang digunakan dalam penanaman eksplan (Fardiaz 1992: 4).

Menurut Pramono (2007: 1), bahwa metode sterilisasi alat dan bahan tanaman juga dilakukan sterilisasi dalam kegiatan  kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril,  yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril.  Sterilisasi lingkungan kerja yaitu sterilisasi yang dilakukan dalam penanaman eksplan agar mendapat tempat atau ruang yang steril dan bebas dari mikroorganisme. Tempat untuk menanam dan memindahkan eksplan yaitu disebut Laminar Air Flow. Dengan dihembuskannya aliran udara halus  dari blower melalui suatu filter HEPA (High Efficiency Particulate Air) dengan pori-pori kurang dari 0,3 µm. Fungsi aliran udara ini yaitu dapat mencegah kontaminan yang air borne selama penanaman. Sebelum bekerja, bagian dalam laminar disterilkan dengan alcohol 70% dan diratakan dengan tissue, kemudian dilanjutkan dengan menyalakan lampu UV selama 0,5-1 jam untuk mematikan kontaminan di permukaan tempat kerja.

Sterilisasi alat dan media dilakukan pada alat-alat seperti botol, erlenmeyer, beaker glass, petridish, pinset, scalpel, gunting, jarum ose, dll sebaiknya sebelum disterilisasi peralatan dicuci denga detergen kemudian dibilas dengan aquades dan dikeringkan. Kemudian dibungkus dengan kertas merang. Temperatur yang digunakan untuk sterilasasi alat-alat dengan autoclave 121°C pada tekanan 17,5 psi selama 20-30 menit. Sterlisasi bahan tanam yaitu bahan tanam yang ada dilapangan banyak mengandung debu, kotoran-kotoran dan berbagai kontaminan hidup pada permukaan. Apabila kontaminan ini tidak dihilangkan maka media yang mengandung gula, vitamin, dan mineral merupakan sumber energy bagi kontaminan yang ada. Prinsip sterilasasi eksplan adalah dapat mematikan kontminan tanpa membunuh eksplan, karena baik kontaminan maupun eksplan merupakan benda hidup. Berhasilnya teknik sterilsasi merupakan langkah awal keberhasilan dalam kerja kultur in vitro (Hadioetomo 1993: 1).

BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1. Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari Selasa, tanggal 06 November  2012 pada pukul 09.00 s/d selesai. Bertempat di Laboratorium Botani Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam di Universitas Sriwijaya Indralaya.

3.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini adalah aluminium foil, autoklaf, botol kultur, erlenmeyer, gunting kultur, kertas pembungkus, lampu bunsen, petridish, pinset dan scapel, sedangkan bahan yang dibutuhkan adalah  aquades dan medium.

3.3. Cara Kerja

    Disiapkan alat-alat yang berupa aluminium foil, Erlenmeyer, gunting, petridish, pinset tetes, scapel kemudian  dibungkus dengan kertas pembungkus. Botol kultur ditutup dengan aluminium foil. Sedangkan bahan-bahan berupa aquades dan medium disterilisasikan dengan cara dimasukkan dalam botol lalu ditutup dengan aluminium foil. Disterilisasi alat dan bahan dengan autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 15 psi selama 20-30 menit.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1.  Hasil

Berdasarkan praktikum didapatkan hasil sebagai berikut :

No.	Nama Alat	Gambar	Keterangan
1.	Autoklaf		Autoklaf adalah alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jaringan. Suhunya 121oC, tekanan uap 15 selama 15 menit
2.	Magnetic Stirer		Magnetic  stirer memiliki fungsi untuk menggojok dengan pemanas. Dengan                       menggunakan listrik, alat ini berfungsi sebagai kompor selain digunakan  sebagai penggojok.
3.	Elenmeyer		Alat ini digunakan dalam kultur jaringan tanaman sebagai sarana menuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan.
4.	Gelas ukur		Gelas ukur digunakan untuk menakar air suling dan bahan kimia yang akan digunakan.
5.	Pipet tetes		Pipet tetes digunakan untuk mengambil supernatan (larutan) protoplas atau untuk menambahkan KOH, HCL, menetralkan pH.
6.	Botol kultur		Botol ini digunakan untuk tempat menanam eksplan
7.	Gelas piala		Alat ini digunakan untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan air suling dalam pembuatan medium
8.	Gunting kultur		Alat ini digunakan untuk mengiris bagian tanaman atau eksplan.
9.	Aluminium foil		Aluminium foil berfungsi untuk menutup botol kultur.
10.	Pinset		Pinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk menanam eksplan
11.	Cawan petri		Alat ini digunakan untuk tempat eksplan
12.	Scalpel		Alat ini digunakan untuk mengiris bahan isolasi protoplas
13.	Kertas Pembungkus		Kertas digunakan untuk membungkus alat-alat yang akan di sterilisasi

4.2. Pembahasan

       Berdasarkan hasil praktikum yang dilakukan diketahui beberapa alat-alat seperti erlenmeyer, pipet tetes, pinset, disseting set, gunting, magnetic stirer, scaple, botol kultur dan lain-lain. Dari alat-alat yang mempunyai fungsi dan cara pemakaian yang berbeda, namun disterilisasikan bersama menggunakan autoklaf. Sterilisasi adalah segala kegiatan dalam kultur jaringan yang sangat penting dan harus dilakukan ditempat yang steril, yaitu di laminar flow. Seperti yang diungkapkan Wetherell (1976: 1), bahwa lingkungan aseptic sebagai salah satu syarat utama suksesnya kegiatan kultur jaringan perlu diterapkan dengan sungguh-sungguh. Untuk itu perlu adanya usaha sterilisasi peralatan dan media yang akan digunakan dalam proses kultur agar bebas dari mikroba.

   Sterilisasi secara umum terdiri dari sterilisasi fisika, sterilisasi kimia dan sterilisasi modifide yaitu gabungan antara sterilisasi fisika dan kimia. Menurut Yuan (2012: 2), bahwa ada beberapa metode sterilisasi alat dan bahan tanaman yang dilakukan dengan beberapa cara yaitu dengan pembakaran, pemanasan kering, pemanasan basah, penyaringan atau secara kimiawi. Sterilisasi alat dan bahan tanaman juga dilakukan sterilisasi dalam kegiatan  kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, dan menggunakan alat-alat yang juga steril yaitu sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi alat dan media dan sterlisasi bahan tanam.

  Jenis sterilisasi yang baik digunakan adalah sterilisasi menggunakan autoklaf.         Autoklaf yaitu alat yang berfungsi untuk sterilisasi dengan uap panas bertekanan. Autoklaf dipakai untuk sterilisasi medium atau larutan atau alat-alat yang tidak tahan suhu tinggi. Prinsip kerjanya yaitu mensterilkan dengan bantuan uap. Menurut Wetherell (1976: 1), dalam waktu 10-15 menit hampir semua sel-sel mikroba dapat terbunuh oleh uap air yang sangat panas. Untuk mensterilisasi alat-alat dibutuhkan suhu uap air 250 oF (121°C) dalam waktu 15 menit. Untuk menaikkan suhu yang lebih tinggi dari titik didih tersebut yaitu dengan menaikkan tekanan uap air. Sedangkan menurut Estuningsih (2012: 1 ), jika panas digunakan bersama-sama dengan uap air disebut sterilisasi basah mengggunakan autoklaf, sedangkan jika tanpa uap air disebut sterilisasi kering menggunakan oven. Pada praktikum yang dilakukan hanya menggunakan sterilisasi basah yaitu menggunakan autoklaf.

  Percobaan sterilisasi kultur jaringan dilakukan dengan baik, kita bisa membuat kisaran konsentrasi dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi dengan rentang yang cukup lebar. Jika dengan konsentrasi tertentu tidak terkontaminasi tetapi eksplannya mati, berarti konsentrasinya harus diturunkan. Begitu juga sebaliknya, jika masih banyak kontaminannya, konsentrasi bahan harus dinaikkan supaya tidak terkontaminasi lagi. Sama juga halnya dengan waktu yang diperlukan untuk  sterilisasi. Jika masih banyak kontaminasi, berarti proses sterilisasi harus lebih lama. Jika kita telah berhasil mendapatkan satu kultur jaringan saja yang bebas kontaminan, maka kita dapat memperbanyaknya dalam jumlah banyak.

    Fungsi alat yang disterilisasikan adalah untuk menghindari adanya mikroorganisme yang masih terbawa oleh alat-alat yang akan digunakan, karena adanya mikroorganisme menyebabkan kontaminasi bahkan dapat menumbuh kembangkan bakteri yang belum benar-benar steril. Suatu alat atau bahan dikatakan steril apabila alat atau bahan  tersebut bebas dari mikrobia, baik dalam bentuk vegetative ataupun spora. Suatu benda atau substansi hanya dapat dikatakan steril atau tidak steril, tidak  akan pernah mungkin ada setengah steril atau hampir steril. Untuk sterilisasi alat dan medium juga digunakan sterilisasi dengan mengunakan alat yang disebut autoclave. Sterilisasi dilakukan untuk membunuh bakteri dan cendawan yang melekat pada eksplan maupun pada alat serta bahan yang digunakan dalam penanaman eksplan (Fardiaz 1992: 4).

    Labu erlenmeyer berfungsi sebagai tempat penyimpanan medium, memanaskan larutan, dan menampung hasil dari penyaringan. Di dalam kultur jaringan aluminium foil berfungsi untuk menutup botol kultur. Pipet tetes fungsinya sama dengan pipet ukur yaitu digunakan untuk memindahkan suatu cairan atau larutan, namun volume yang dipindahkan tidak diketahui. Lampu bunsen salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar spiritus. Alat-alat ini dapat disterilisasikan dengan dibungkus aluminium foil, lalu disterilisasi dengan menggunakan autoklaf.

BAB V

KESIMPULAN

                  Dari hasil praktikum yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa :

1.        Sterilisasi alat dilakukan pada alat-alat seperti botol, erlenmeyer, beaker glass, petridish, pinset, scalpel, gunting, jarum ose, dll sebaiknya sebelum disterilisasi peralatan dicuci denga detergen kemudian dibilas dengan aquades dan dikeringkan. Kemudian dibungkus dengan kertas merang dan dimsukkan ke dalam autoklaf.

2.        Temperatur yang digunakan untuk sterilasasi alat-alat dengan autoclave 121°C pada tekanan 15 psi selama 20-30 menit.

3.        Fungsi sterilisasikan adalah untuk menghindari adanya mikroorganisme yang masih terbawa oleh alat-alat yang akan digunakan, karena adanya mikroorganisme menyebabkan kontaminasi bahkan dapat menumbuh kembangkan bakteri yang belum benar-benar steril.

4.        Segala peralatan yang digunakan dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril melalui proses sterilisasi.

5.        Sterilisasi adalah membebaskan bahan dari semua mikroba. Cara sterilisasi terdapat kesamaan seperti pada oven dan autoclave. Hanya saja yang menjadi perbedaan yaitu metode penggunaannya.

  

DAFTAR PUSTAKA

Daisy. 1994. Laporan Kultur Jaringan. http://blogspot.com/2012/02/laporan-kultur-jaringan-pembuatan-media_822.html. 1 ± 2 diakses pada tanggal 8 November 2012.

Fardiaz. 1992. Cara Steilisasi Alat-alat dan Media Kultur Jarngan. http://eshaflora.blogspot.com/2010/02/cara-sterilisasi-alat-alat-dan-media.html. 1 ± 2 diakses pada tanggal 8 November 2012.

Hadioetomo, R.S. 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT.Gramedia: Jakarta. 237 hal.

Hamdan. 2012. Laporan Kultur Jaringan Sterilisasi Alat. http://hamdan-maruli.blogspot.com/2012/02/lap-kultur-jaringan-sterilisasi-alat.html. 1 ± 2 diakses pada tanggal 8 November 2012.

Hendaryono & wijayani. 2002. Media Kultur Jaringan. http://kultur-jaringan. blogspot.com/2009/08/media-kultur-jaringan.html. 1 ± 2 diakses pada tanggal 8 November 2012.

Sany. 2007. Pembiakan Tanaman Melalui Kultur Jaringan. Jakarta: Gramedia. 213 hal.

Pramono. 2007. Sterilisasi dalam Kultur Jaringan. http://sterilisasi-dalam-kultur-jaringan.blogspost.com/2012/09/kultur-jaringan.html. 1 ± 2 diakses pada tanggal 8 November 2012.

Yuan. 2012. Kultur Jaringan Sterilisasi. http://yuangaknekoneko.blogspot.com/2012/03/kultur-jaringan-sterilisasi.html. 1 ± 2 diakses pada tanggal 8 November 2012.

Wetherell, dkk. 1976. Biologi. Jakarta: Erlangga. 211 hal.