ISOLASI Monascus sp Angkak

Pendahuluan
Angkak merupakan salah satu pewarna alami yang diperoleh dari cendawan. Cendawan yang berperan adalah jenis Monascus sp. dan biasanya adalah Monascus purpureus. Cendawan ini biasa dikulturkan dalam butir beras dan dibiarkan mengkolonisasi beras. Dari hasil pertumbuhannya, mampu dihasilkan pigmen warna merah dan beberapa metabolit lain yang berguna bagi manusia.
Pengolahan bahan pangan berupa bahan mentah yang diikuti fermentasi telah menjadi budaya di berbagai belahan dunia, khususnya di Asia. Salah satu bahan pangan tradisional yang diolah dengan fermentasi adalah keju, tape, tape ketan, arak beras, anggur, dan lain sebagainya. Pengolahan bahan pangan dengan fermentasi mampu meningkatkan daya simpan, daya cerna, dan penerimaan manusia terhadap makanan tersebut.
Kultur Monascus sp. dapat ditumbuhkan pada media cair. Aktivitas produksi pigmen dapat diketahui dengan menumbuhkan Monascus sp. pada media cair dengan substrat yang berbeda. Selain itu, aktivitas pewarnaan pigmen dari angkak dapat diujikan pada tape singkong untuk mengetahui pengaruh pigmen pada penampakan tape dan pertumbuhan ragi dalam fermentasi tape.
Bahan dan Metode
Isolasi Monascus sp. dan pertumbuhannya dalam berbagai media cair
Isolat Monascus sp. diperoleh dari produk angkak komersil berupa biakan Monascus sp. pada beras koleksi Ibu Lisdar E Manaf. Sebanyak 3 butir beras angkak diinokulasikan ke dalam media Malt Extract Agar yang ditambahkan antibiotik. Biakan kemudian diinkubasi selama 1 minggu.
Biakan hasil inkubasi dipilih yang terbaik digunakan untuk penyimpanan biakan dan menumbuhkannya ke dalam berbagai media cair. Media cair yang digunakan adalah media cair tepung ketan putih 15%, media cair tepung beras 15%, dan media cair tapioka 15%. Kontrol yang digunakan adalah media air gula 15%. Masing-masing media memiliki volume 200 ml dan diletakkan di dalam labu Erlenmeyer (3 ulangan). Inokulasi ke dalam media cair dilakukan setelah 1 minggu sejak inokulasi pada media Malt Extract Agar.
Setelah inkubasi selama 7 hari dilakukan analisis pigmen angkak dengan pengamatan filtrat dari biakan Monascus sp. pada masing-masing media cair. Pengamatan dilakukan dengan pengukuran absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer UV. Selain pengukuran absorbansi filtrat, dilakukan pengukuran absorbansi ekstrak sel. Ekstraksi sel dilakukan dengan menggunakan methanol. Absorbansi diukur dengan menggunakan spektrofotometer.
Pengaruh pigmen Monascus sp. terhadap fermentasi dalam pembuatan tape
Sebanyak 1 sdm beras angkak dimasukkan ke dalam panci berisi air dan singkong yang dilanjutkan dengan perebusannya. Perebusan dilakukan sampai singkong setengah matang. Kontrol yang digunakan adalah perebusan singkong tanpa penambahan beras angkak.
Singkong kemudian ditiriskan dan ditunggu sampai dingin. Singkong yang telah dingin diinokulasi dengan ragi komersial untuk dilakukan fermentasi tape. Tape yang telah matang kemudian diamati dan diuji secara organoleptik.
Selain pembuatan tape, dilakukan pengujian fermentasi langsung ragi tape pada beras angkak. Beras angkak dimasak setengah matang dan dilanjutkan dengan penaburan ragi tape di atas permukaan beras angkak.
Hasil
Isolasi Monascus sp. dan pertumbuhannya dalam berbagai media cair
Inokulasi beras angkak pada media Malt Extract Agar diamati setelah 1 minggu inkubasi. Miselium Monascus sp. dapat tumbuh pada media, namun, terdapat kontaminasi pada media (Gambar 1).
Gambar 1 Inokuasi beras angkak pada media Malt Extract Agar
Inokulasi Monascus sp. pada berbagai media cair menunjukkan hasil visual berupa kepekatan warna merah yang berbeda-beda. Warna merah paling pekat ditunjukkan pada biakan pada media cair tepung beras ketan 15%, diikuti dengan media cair tepung beras 15%, media cair tapioka 15%, dan media cair kontrol (Gambar 2).
Gambar 2 Produksi pigmen Monascus sp. dalam berbagai media cair. A: air gula 15%, B: Tepung beras 15%, C: Tepung beras ketan 15%, D: tapioka 15%
Produksi pigmen berdasarkan pengamatan visual pada masing-masing substrat sebanding dengan biomassa sel yang dihasilkan selama inkubasi. Biomassa sel paling tinggi diperoleh pada media cair tepung beras ketan 15% dan paling rendah diperoleh pada media cair tapioka 15% (Gambar 3).
Gambar 3 Biomassa sel yang dihasilkan setelah tujuh hari inkubasi pada produksi pigmen dengan substrat yang berbeda.
Filtrat yang berasal dari kultur media cair dengan berbagai substrat diukur dengan menggunakan spektrofotometer. Hasil pengukuran dapat dilihat pada Tabel 1. Absorbansi ekstraksi sel dengan menggunakan methanol dapat dilihat pada Gambar 4 dan Tabel 2.
Tabel 1 Pengukuran absorbansi filtrat dari media cair
Substrat Panjang gelombang (nm) Absorbansi
Tepung ketan 15% 200,5 0,362
304 0,050
482,5 0,022
Tepung beras 15% 219,5 1,654
303,5 1,484
Tapioka 15% 212 1,033
304 0,578
Gula 15% 200 0,354
304 0,031
Gambar 4 Pengukuran absorbansi pada ekstrak sel yang dilarutkan dengan methanol. A: gula 15%, B: Tepung beras 15%, C: Tepung beras ketan 15%, D: tapioka 15%
 
Tabel 2 Pengukuran absorbansi pada ekstrak sel yang dilarutkan dengan methanol
Substrat Panjang gelombang (nm) Absorbansi
Tepung ketan 15% 240 2,48
301 2,176
349,5 1,947
471,5 2,224
489,5 1,227
Tepung beras 15% 237,5 2,352
301,5 1,650
349 1,520
402,5 1,890
494,5 0,816
Tapioka 15% 224,5 0,694
271,5 0,403
466 0,406
Gula 15% 223,5 0,292
398,5 0,90
Keterangan : Untuk ekstrak sel pada media cair tepung beras 15% diencerkan ½ kali karena tidak terbaca oleh spektrofotometer.
Pengaruh pigmen Monascus sp. terhadap fermentasi dalam pembuatan tape
Hasil rebusan singkong bersama beras angkak menunjukkan pigmen merah yang meresap ke dalam singkong (Gambar 4). Tekstur singkong yang dihasilkan tidak jauh berbeda dengan singkong yang direbus dengan cara biasa. Setelah dilakukan fermentasi dengan menggunakan ragi, tape diuji secara organoleptik. Hasil uji organoleptik dapat dilihat pada Tabel 3.
Gambar 4 hasil perebusan singkong yang ditambahkan beras angkak
 
Tabel 3 Data organoleptik tape yang diwarnai dengan pigmen dari Monascus
NO KARAKTER TAPE I TAPE II TAPE III KONTROL
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
Preference test
1 Kesukaan 2 3 3 1 1 5 3 2 2 4 1 1 2 2 1 3
2 Tekstur 1 4 3 1 5 4 2 2 3 1 1 4 4
3 Rasa 1 3 5 1 6 2 1 3 3 1 1 2 4 2
4 Aroma 2 5 2 2 1 6 1 3 5 1 3 2 3
5 Warna 3 3 3 3 6 2 5 2 1 3 5
Difference test
1 Kelunakan 3 4 2 1 4 4 1 4 4 1 1 4 3
2 Asam 1 4 2 1 1 4 3 1 3 3 1 2 1 2 3 3
3 Aroma 4 6 1 5 4 4 3 2 3 4 2
4 Warna (kuning/merah) 1 4 3 1 1 3 5 2 1 5 1 2 5 1 1
Keterangan: 1=sangat tidak suka 2=tidak suka 3=netral 4=suka 5=sangat suka
Pembahasan
Isolasi Monascus sp. dan pertumbuhannya dalam berbagai media cair
Monascus sp. mampu tumbuh pada media Malt Extract Agar (Gambar 1). Namun, media juga mengalami kontaminasi. Kontaminasi yang muncul berupa jenis bakteri dan cendawan. Kontaminasi disebabkan karena tidak dilaksanakannya teknik aseptik dengan baik. Kontaminasi dapat berasal dari udara atau peralatan yang digunakan.
Hasil pengamatan secara visual kultur Monascus sp. dalam media cair berbagai substrat menunjukkan adanya perbedaan kepekatan warna yang dihasilkan (Gambar 2). Kultur Monascus sp. pada media cair tepung beras ketan 15% memiliki kepekatan yang paling tinggi, diikuti oleh media cair tepung beras 15%, media cair tapioka 15%, dan kontrol. Sedangkan pada pengukuran filtrat dengan spektrofotometer UV, absorbansi pada dua panjang gelombang menunjukkan hasil yang berbeda dengan pengamatan visual (Tabel 1). Hal ini bisa jadi disebabkan oleh filtrat yang tidak murni, masih mengandung pengotor seperti sisa tepung atau bagian tubuh Monascus sp..
Hasil absorbansi pigmen angkak pada ekstraksi sel dengan metanol (Gambar 4, Tabel 2) memiliki perbedaan dengan absorbansi filtrat media cair (Tabel 1) dan pengamatan visual (Gambar 2). Ekstraksi sel ini memungkinkan filtrat yang lebih bersih dan kemungkinan pigmen yang diperoleh lebih banyak. Absorbansi paling tinggi diperoleh dari media cair tepung beras 15%. Kepekatan warna pada media cair disebabkan oleh produksi pigmen oleh Monascus sp.. Pigmen merah yang dihasilkan Monascus sp. ini disebut monascorubrin (C22H24O5) dan pigmen warna kuningnya disebut monascoflavin (C17H22O4) (Gray 1970). Perbedaan produksi pigmen memiliki kaitan dengan komposisi nutrisi dalam setiap substrat dari media cair.
Menurut Danuri (2008), produksi pigmen dan lovastatin tinggi pada kultur Monascus sp. dalam media beras. Hal ini disebabkan kandungan amilosa (25-33%) yang lebih tinggi pada beras dibanding amilokpektin. Amilosa lebih mudah didegradasi oleh Monascus sp. dibanding dengan amilopektin sehingga mudah digunakan sebagai substrat pertumbuhan. Jika dibandingkan dengan beras ketan (Oryza sativa qlutinous), beras ketan mengandung 80% karbohidrat, 4% lemak, 6% protein 6%, dan 10% air. 1% dan 99%. Karbohidrat (pati) pada beras ketan mengandung 1-2% amilosa dan 88-89% amilopektin.
Absorbansi terendah terdapat pada media cair tapioka 15% (Tabel 2). Absorbansi yang rendah menunjukkan rendahknya pigmen angkak yang dihasilkan. Menurut Carvalho et al. (2005), produksi pigmen pada substrat tepung tapioka oleh Monascus sp. galur CCT3802 dan NRRL1991 lebih rendah kurang lebih sebesar 8 kali dibandingkan produksinya pada substrat beras, sedangkan produksi pigmen Monascus sp. galur LPB31 pada substrat tepung tapioka lebih rendah sebesar 4 kali daripada produksinya pada susbtrat beras.
Dilihat dari komposisi tapioka, tapioka memiliki konsentrasi karbon dan nitrogen yang lebih rendah dibandingkan beras ketan dan beras biasa. Tapioka berasal dari akar ubi kayu (kasava) yang diolah menjadi tepung. Analisis terhadap akar ubi kayu yang khas mengidentifikasikan terdapat kandungan kadar air 70%, pati 24%, serat 2%, protein 1% serta komponen lain (mineral, lemak, gula) 3%. Komposisi nutrisi dalam tapioka ini diduga mempengaruhi pertumbuhan Monascus sp.. Jika dibandingkan dengan media yang mengandung glukosa dan maltose, media yang tapioka akan memberikan hasil produksi pigmen Monascus sp. yang lebih tinggi (Timotius 2005).
Produksi pigmen Monascus sp. pada substrat tapioka dipengaruhi oleh penambahan nutrisi tambahan dari luar. Carvalho et al. (2006) menyatakan bahwa produksi pigmen Monascus sp. dengan substrat tepung tapioka maupun produk singkong lainnya memerlukan penambahan nitrogen, fosfor, dan sumber mikronutrien.
Substrat-substrat yang digunakan memiliki kandungan karbohidrat, protein dan fosfor dalam jumlah yang mirip. Meskipun demikian, pigmen yang dihasilkan dari berbagai substrat tersebut berbeda. Hal ini disebabkan sumber karbon dan sumber nitrogen diketahui berpengaruh terhadap pertumbuhan sel dan produksi pigmen (Pastrana et al 1995; Vidyalakshmi et al. 2009). Konsentrasi karbon dan nitrogen yang terlalu tinggi justru menyebabkan turunnya pertumbuhan sel dan produksi pigmen (Lee et al. 2001). Selain itu, penambahan beberapa mineral pada media mampu meningkatkan produksi angkak secara signifikan (Danuri 2008).
Selain memproduksi pigmen, Monascus sp. juga dapat menghasilkan enzim α dan β–amilase, glukoamilase, protease, dan lipase (Permana et al. 2004). Enzim ini digunakan Monascus sp. untuk dapat memanfaatkan substrat yang terdapat dalam media produksi, menggunakannya sebagai sumber energi dan sebagai sumber C, dan N penyusun komponen sel. Selain itu, Monascus sp. diketahui mampu memproduksi lovastatin. Produksi lovastatin oleh Monascus pilosus ditekan oleh glukosa dan diaktifasi oleh maltosa, dan pada konsentrasi berlebih nitrogen menghambat produksi lovastatin (Miyake et al. 2006). Dalam penelitian lainnya dilaporkan bahwa konsentrasi lovastatin yang diproduksi oleh Monascus sp. relatif lebih tinggi dalam media dengan glukosa sebagai sumber karbon dibandingkan maltosa, namun konsentrasi tertinggi dihasilkan dari kultur dengan soluble starch sebagai sumber karbon (Lee et al. 2001). Selain dipengaruhi oleh sumber karbon dan sumber N, produksi lovasttain juga dipengaruhi oleh temperatur, lamanya waktu fermentasi, pH, serta jumlah inokulum (Panda et al. 2008).
Produksi pigmen pada masing-masing substrat sebanding dengan biomassa sel Monascus sp. yang diperoleh selama masa pertumbuhan atau masa inkubasi (Gambar 3). Biomassa sel terbentuk dari pertumbuhan sel. Semakin baik pertumbuhan sel, semakin banyak biomassa yang terbentuk dan semakin banyak pigmen yang dihasilkan. Di sisi lain, penggunaan air terlalu banyak dalam media tumbuh cair mampu menghambat pertumbuhan Monascus sp. (Gray 1970).
Pada umumnya produksi pigmen Monascus sp. secara tradisional menggunakan fermentasi pada media padat, namun sekarang ini Monascus sp. telah berhasil dikulturkan dalam media cair dan produksi skala industri juga telah menggunakan cara ini. Keuntungan penggunaan tepung-tepungan sebagai substrat dalam fermentasi Monascus sp. adalah bahan yang mudah diperoleh dan terjangkau, tidak berwarna, serta mudah dapat langsung dicerna dan dimanfaatkan oleh kapang. Namun, fermentasi kapang Monascus dalam media cair dengan tepung-tepungan sebagai substrat memiliki kesulitan, antara lain, kekentalan yang tinggi dari tepung kasar menghalangi penggunaan dalam konsentrasi tinggi, menghasilkan konsentrasi akhir sel dan pigmen yang relatif rendah, karena tidak cukupnya suplai oksigen untuk produksi pigmen yang tinggi akibat media terlalu kental (Lee et al 1995).
Pengaruh pigmen Monascus sp. terhadap fermentasi dalam pembuatan tape
Dari keseluruhan parameter pada uji organoleptik, nilai tertinggi adalah 3 sampai 4, yaitu netral dan suka, hasil yang sama juga diperoleh dari kontrol. Hal ini dapat diartikan bahwa antara kontrol dan perlakuan (tape dengan pewarna angkak) tidak terlalu berbeda baik kelunakan, rasa, tekstur maupun aroma, namun disukai. Tidak diketahui daya simpan tape hasil praktikum. Bisa jadi terdapat pengaruh pigmen angkak pada daya simpan tape. Menurut Law et al. (2011) daya simpan tape biasa dapat bertahan sampai 3-4.
Hasil fermentasi yang menunjukkan tidak berbeda nyata antara perlakuan pemberian angkak terhadap substrat ubi kayu maupun beras merah mengindikasikan bahwa pewarna angkak tidak mempengaruhi ragi tape dalam aktivitasnya untuk mengubah substrat menjadi tape.
Tape merupakan singkong hasil fermentasi oleh ragi. Pada daerah Peninsular Malaysia tape memiliki popularitas yang baik sebagai bahan pangan yang dapat langsung dimakan atau diolah menjadi bahan pangan lain (Law et al. 2011). Pengolahan tape menjadi bahan pangan lain salah satunya adalah dibuat menjadi kek atau makanan ringan. Adanya pigmen warna merah dari Monascus sp. mampu member penampakan yang baik pada tape. Namun, jika tape diolah menjadi bahan pangan lain tidak diketahui apakah warna merah tape masih terlihat atau tidak.
Kesimpulan
Monascus sp. berhasil diisolasi dari beras angkak komersil. Pada inokulasi Monascus sp. dalam kultur media cair berbagai substrat, pigmen paling banyak terdapat pada kultur media cair tepung beras 15%. Kandungan amilosa dalam beras memungkinkan Monascus sp. tumbuh dengan baik. Tape dengan warna merah dari pigmen Monascus sp. berhasil dibuat. Hasil uji organoleptik menunjukkan penerimaan terhadap tape netral sampai suka.
Daftar Pustaka
Carvalho JC, Bruno OO, Ashok P, Carlos RS. 2005. Biopigments from Monascus: Strains Selection, Citrinin Production and Color Stability Brazilian Archiv and Technol 48: 885-894.
Carvalho JC et al. 2006. Effect of substrates on the production of Monascus biopigments by solid- fermentation dan pigment extraction using different solvents. Indi J Biotechnol 6: 194-199.
Danuri H. 2008. Optimizing Angkak Pigments and Lovastatin Production By Monascus purpureus. Hayati 15 (2): 61-66
Gray WD. 1970. The Use of Fungi As Food and in Food Processing. CRC Press, Ohio.
Law SV, Abu Bakar F, Mat Hashim D, Abdul Hamid A. 2011. Popular fermented foods and beverages in Southeast Asia. International Food Research Journal 18: 474-483.
Lee YK, Chen DC, Chauvatcharin S, Seki T, Yoshida T. 1995. Production of Monascus pigments by solid-liquid state culture method. J Ferm Bioeng 79(5): 516-518.
Lee BK, Park NH, Piao HY, Chung WJ. 2001. Production of red pigments by Monascus sp. in submerged culture. Biotechnol Bioprocess Eng 6: 341-346.
Panda BP, Saleem J, Mohammad A. 2008.Optimization of Fermentation Parameters for Higher Lovastatin Production in Red Mold Rice through Co-culture of Monascus sp. and Monascus ruber. Food Bioprocess Technol : 008-0072.
Pastrana L, Blanc PJ, Santerre AL, Loret MO, Goma G. 1995. Production of red pigments by Monascus ruber in synthetic media with a strictly controlled nitrogen source. Process Biochem 30(4): 333-341.
Permana DR, Sunnati M, Tisnadjaja D. 2004. Analisis Kualitas Produk Fermentasi Beras (Red Fermented Rice) dengan Monascus sp. 3090. Biodiversitas 5: 7-12.
Timotius KH. 2005. The influence of tapioca on the growth, the activity of glucoamylase and pigment production of Monascus sp. UKSW 40 in soybean-soaking wastewater. World J Microbiol Biotechnol 21: 615-617.
Vidyalakshmi R, Paranthaman R, Murugesh S, Singaravadivel K. 2009. Stimulation of Monascus pigments by invention of different nitrogen sources. Global J Biotechnol Biochem 4(1): 25-28.