MENENTUKAN KURVA PERTUMBUHAN BAKTERI

DASAR TEORI

Studi mengenai pertumbuhan populasi bakteri memerlukan inokulasi sel-sel yang viabel ke dalam media cair steril, dan inkunasi kultur pada kondisi aerob, temperatur, dan pH optimum. Pada kondisi ini sel-sel akan secara cepat bereproduksi. Dan dinamika pertumbuhan mikroba dapat dipetakan dalam kurva pertumbuhan populasi, yang dibuat dengan memplotkan meningkatan jumlah sel terhadap waktu inkubasi. Kurva pertumbuhan bakteri dapat digunakan untuk menggambarkan tahap-tahap dari siklus pertumbuhan bakteri. Kurva juga memudahkan pengukuran jumlah sel dan kecepatan pertumbuhan dari organisme pada kondisi yang distandarkan sebagai waktu generasi, yaitu waktu yang dibutuhkan oleh mikroba untuk mengganda.

Pembentukan kurva pertumbuhan yang sempurna memerlukan waktu sekitar 24 jam dalam labu kultur yang diinkubasi di shaker (alat penggojok), populasinya diukur selama inkubasi dengan interval waktu tertentu. Tetapi untuk percobaan laboratorium tidak diharuskan untuk mencapai kurva pertumbuhan sempurna. Oleh karena itu, percobaan berikut ini mengikti prosedur yang dimodifikasi untuk mendapatkan fas lag dan fase log saja. Kurva akan diplotkan pada kertas semilog dengan menggunakan dua nilai pengukuran pertumbuhan. Metode langsung memerlukan penghitungan sel-sel viabel menggunakan pengenceran seri dari sampel kultur uji yang diambil tiap interval waktu 30 menit. Sedangkan metode tidak langsung dilakukan dengan pengukuran peningkatan kekeruhan kultur bakteri menggunakan metode turbiditas dengan bantuan alat spektrofotometer. Perningkatan kekeruhan pada tiap interval waktu 30 menit dipakai sebagai indikator terjadinya peningkatan massa sel.

Siswa akan menentukan waktu generasi dengan metode Lngsung dan tidaklangsung dari data kurva pertumbuhan. Penentuan tidak langsung dengan cara yang sederhana dari fase log seperti pada Gambar 1. Pilihlah dua titik densitas opyik, misalnya 0.2 dan 0.4, yang mempresentasikan turbiditas yang negganda. Dengan menggunakan penggaris, gambarkan garis antara dari tiap densitas optik yang terpilih pada ordinat dengan garis dari kurva pertumbuhan. Kemudian buat garis tegak lurus dari titik-titik akhir pada kurva pertumbuhan terhadap absis interval waktunya masing-masing. Dengan persamaan sebagai berikut, tentukan wantu generasinya.

GT= t_{(O.D. 0.4)} – t_(O.D.0.2)

GT= 90 menit - 60 menit = 30 menit

Metode langsung menggunakan skala jumlah sel pada kurva pettumbuhan dengan persamaan di bawah ini:

g = __t log 2__

log b - log B

g = waktu generasi

B = jumlah sel bakteri pada fase awal log, atau titik dalam fase log

b = jumlah sel bakteri pada akhir fase log

t = waktu dalam jam atau menit antara B dan b.

BAHAN-BAHAN

Kulttur

Kultur bakteri Escherichia coli yang berumur 10 hingga 12 jam dalam media Nutrient Broth (NB). Kultur dapat dipertahankan dengan fase log dengan menyimpan dalam pendingin100 ml NB dalam labu Erlenmeyer 250 ml, 35 buah tabung reaksi berisi 9 ml akuades steril, dan 500 ml NA (Nutrien Agar) dalam 5 botol.

Alat

Shaker inkubator, Spektrofotometer (Spectronic 20, Milton Roy), tabung cuvet, hand taily counter, colony counter, dua puluh delapan cawan Petri, pipet steril 1 ml dan 10 ml, gelas Beaker 1000 ml, Bunsen.

PROSEDUR

1. Bagilah ke 35 akuades steril 9 ml menjadi 7 set masing-masing 5. Beri label tiap set sesuai dengan waktu inokulasi (t₀, t₃₀, t₆₀, t₉₀, t₁₂₀, t₁₅₀) dan tiap set beri label sesuai pengencerannya (10^-2,10^-3,10^-4,10^-5,10^-6).
2. Beri label tujuh set cawan petri sesuai dengan waktu inolukasi, faktor pengenceran yang dicawankan (10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7) dan beri identitas Anda.
3. Cairkan ke 5 botol NA dalam water bath. Dinginkan dan pertahankan pada suhu 45˚C.
4. Dengan pipet steril, tambahkan 5 ml kultur E. Coli yang masih pada fase log ke dalam labu yang berisi 100 ml NB yang sudah dilabel inisial Anda. O.D. awal (t₀) harus berkisar antara 0.08 hingga 0.1 pada 610 nm. Cara penggunaan spektrofotometer mengacu pada praktikum 8.
5. Setelah t₀ O.D. ditentukan, vortex labu ukur dan secara aseptik pindahkan 1 ml ke dalam akuades 9 ml yang berlabel 10^-2 dan lanjutkan pada seri pengenceran selanjutnya.
6. Letakkan labu kultur dalam shaker inkubator dan atur kecepatan 120 rpm pada suhu kamar (30˚C).
7. Cawankan pengenceran t₀ pada cawan yang berlabel t₀ seperti digambarkan pada Gambar 9.3. secara aseptik tuang 15 ml media Nutrien Agar (NA) cair dalam cawan dan goyangkan dengan gerakan memutar yang teratur.
8. Selanjutnya tiap 30 menit pindahkan secara aseptik 5 ml suspensi kultur dalam kuvet dan ukur densitas optiknya. Juga pindahkan 1 ml suspensi kultur dalam akuades yang berlabel 10^-2 dan interval waktu yang sesuai, lakukan seri pengenceran selengkapnya, dan cawankan dalam cawan petri sesuai labelnya.
9. Jika hasil pour plate dalam cawan petri telah memadat, inkubasikan dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37˚C.

HASIL PENGAMATAN

Titik	Jam	OD ( kelompok D1 )	OD ( Kelompok D2)	OD Rata – Rata
0	10.23	0,09	0,1	0,095
1	10.40	0,11	0,19	0,15
2	11.20	0,15	0,155	0,152
3	13.30	0,45	0,35	0,4
4	14.00	0,5	0,8	0,49
5	15.00	0,75	0,75	0,75
6	16.09	1,05	1,05	1,05
7	16.16	1,2	1,2	1,2

Dari grafik dapat diperoleh persamaan :y = 3.10⁷x – 5.10⁶

Untuk setiap nilai :

x = 0,4 , y = 7.10⁶

x = 0,49 , y = 9,7 . 10⁶

x = 0,75 , y = 17,5.10⁶

x = 1,05 , y = 26,5.10⁶

x = 1,2 , y = 31.10⁶

PEMBAHASAN

Suatu piaraan mikroorganisme, misalnya bakteri yang sudah cukup tua kemudian diambil sedikit bakteri untuk ditanam pada medium caior yang cocok. Dalam waktu yang sama bila kita ambil satu kolong kawat inokulasi kemudian disebarkan pada agar-agar lempengan dalam cawan petri. Jumlah koloni yang kemudian tumbuh di cawan dapat kita hitung. Biasanya jumlahnya menjadi sangat besar, maka kita ambil logaritmanya saja.Bila logaritma bentuk bakteri di tulis dalam ordinat, waktu dituliskan dalam absis, maka diperoleh kurva seperti di bawah ini.

Pada gambar di atas, jika suatu bakteri mempunyai waktu generasi 20 menit, berarti 1 sel bakteri tersebut memperbanyak diri menjadi 2 dalam waktu 20 menit. Bila sel tersebut diinkubasikan pada medium pada kondisi yang optimum untuk pertumbuhannya, maka dalam waktu 48 jam sel tersebut akan pembelahan sebanyak 48(60)/20 kali atau 144 generasi. Jumlah sel setelah 48 jam secara teoritis mencapai 2¹⁴⁴ sel. Jika setiap sel mamiliki berat 10^-12gram, maka secara teoritis berat seluruh sel setelah 48 jam akan mencapai 2¹⁴⁴ x 10^-12gram atau 2,2 x 10³¹ gram: atau samadengan4000 kali berat bumi. Pada kenyataanya tidaklah demikian keadaanya, karena tidak semua sel yang terbentuk terus hidup.

· Fase I: fase adaptasi (fase lag)

Bila jasad renik dipindahkan ke dalam suatu medium, mula-mula akan mengalami fase adaptasi. Fase iniuntuk menyesuaikan diri dengan substrat dan kondisi lingkungan di sekitarnya. Fase ini belum terjadi pembelahan sel karena beberapa enzim mungkin belum disintesis. Jumlah sel pada fase ini mungkin tetap, tetapi kadang-kadang menurun. Lamanya fase ini bervariasi,dapat cepat atau lambat tergantung dari kecepatan penyesuaian dengan lingkungan di sekitarnya.

Lamanya fase adaptasi dipengaruhi oleh beberapa faktor, di antaranya adalah sebagai berikut:

(a) Medium dan lingkungan pertumbuhan. Sel yang ditempatkan pada medium dan lingkungan pertumbuhan sama seperti medium dan lingkungan sebelumnya, mungkintidak diperlukan waktu adaptasi. Tetapi jika nutrien yang tersedia dan kondisi lingkungan yang baru sangat berbeda dengan sebelumnya, diperlukan waktu penyesuaian untuk mensintesis enzim-enzim yang dibutuhkan untuk metabolisme.

(b) Jumlah inokulum. Jumlah sel yang semakin tinggi akan mempercepat proses adaptasi. Fase adaptasi mungkin berjalan lambat karena beberapa sebab, misalnya : (1) kultur dipindahkan dari medium yang kaya nutrien ke medium yang kandungan nutriennya terbatas, (2) mutan yang baru terbentuk menyesuaikan diri dengan lingkungannya, (3) kultur yang dipindahkan dari fase statis ke medium baru dengan komposisi sama seperti sebelumnya.

· Fase II: Fase Pertumbuhan Awal = Fase Permulaan Pembiakan

 Setelah mengalami fase adaptasi, sel mulai membelah dengan kecepatanyang masih rendah karena baru selesai tahap penyesuaian diri.

· Fase III: Fase Pertumbuhan Logaritmik (Fase eksponensial atau Fase Pembiakan Cepat)

 Setelahmikroba menyesuaikan diri dengan lingkungannya, yakni pada fase adaptasi dan fase permulaan pembiakan, maka sel jasad renik membelah dengan cepat, dimana pertambahan jumlahnya mengikuti kurva logaritmik. Pada fase ini kecepatan pertumbuhan sangat dipengaruhi oleh medium tempat tumbuhnya seperti Ph dan kandungan nutrien, suhu dan kelembapan udara. Pad fase ini sel membutuhkan energi lebih banyak dibandingkan dengan fase lainnya, selain itu sel paling sensitif terhadap keadaan lingkungan.Bila kita ingin mengadakan piaraan yang cepat tumbuh, maka bakteir pada fase ini baik sekali untuk diadakan inokulum.

· Fase IV: Fase Pertumbuhan Lambat (Fase Pembiakan Diperlambat)

 Pada fase ini pertumbuhan jasad renik diperlambat, karena beberapa sebab misalnya: (1) zat nutrisi di dalam medium sudah sangat berkurang, (2) adanya zat-zat hasil metabolisme yang mungkin beracun atau dapat menghambat pertumbuhan jasad renik. Pada fase ini pertumbuhan sel tidak stabil, tetapi jumlah populasi masih naik. Hal ini karena jumlah sel yang masih tumbuh lebih banyak daripada jumlah sel yang mati.

· Fase V: Fase Pertumbuhan Tetap (Statis)

Pada fase ini jumlah populasi sel tetap karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Ukuran sel pada fase ini lebih kecil karena sel tetap membelah meskipun zat nutrisi sudah habis. Karena kekurangan zat nutrisi, maka kemungkinan sel tersebut mempunyai komposisi berbeda dengan sel yang tumbuh pada fase logaritma . Pada fase ini sel-sel menjadi lebih tahan terhadap keadaan ekstrem seperti panas, dingin, radiasi dan bahan kimia.

· Fase VI: Fase Menuju Kematian dan Fase Kematian

 Pada fase ini sebagian populasi jasad renikmulai mengalami kematian karena sebab, yakni: (1) nutrien di dalam medium sudah habis, (2) energi cadangan di dalam sel habis. Jumlah sel yang mati semakin lama akan semakin banyak, dan kecepatan kematian dipengaruhi kondisi nutrie, lingkungan dan jenis jasad renik.

Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba

Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan jasad renik yang bersifat heterotrof adalah tersedianya nutrien, air, suhu, pH, oksigen, dan potenisal oksidasi reduksi, adanya zat-zat penghambat, dan adanya jasad renik yang lain.

· Nutrien

Jasad renik heterotrof membutuhkan nutrien untuk kehidupan dan pertumbuhannya, yakni sebagai: (1) sumber karbon, (2) sumber nitrogen, (3) sumber energi, (4) dan faktor pertumbuhan, yakni mineral dan vitamin. Nutrien tersebut dibutuhkan untuk membentuk energi dan menyusun komponen-komponen sel. Setiap jasad renik bervariasi dalam kebutuhannya akan zat-zat nutrisi tersebut.

Mikroba yang tumbuh, misalnya pada makanan umunya bersifat heterotrof, yakni menggunakan karbohidrat sebagai sumber energi dan karbon, walaupun komponen organik lainnya yang mengandung karbon mungkin juga dapat digunakan. Kebanyakan organisme heterotrofmenggunakan komponen organik yang mengandung protein sebagai sumber N, tetapi beberapa mikroba dapat pula menggunakan sumber nitrogen anorganik. Oleh karena itu, beberapa organisme heterotrof yang tidak dapat atau kehilangan kemampuan untuk mensintesis berbagai komponen organik, membutuhkan komponen tersebut di dalam substrat pertumbuhannya.

Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, khamir, dan kapang dapat tumbuh dengan baik pada medium yang hanya mengandung glukosa sebagai sumber nutrien organik. Streptokoki, stapilokoki, dan berbagai organisme heterotrof lainnya mungkin membutuhkan beberapa sumber nitrogen organik lainnya dalam bentuk asam amino, purin, pirimidin, serta faktor-faktor pertumbuhan,seperti vitamin B. Vitamiin-vitamin seperti thiamin (vitamin B1), riboflavin (vitamin B2), asam nikotinat (niasin), piridoksin (vitamin B6), asam pantotenat, dan kobalamin (vitamin B12) dibutuhkan oleh organisme yang tergolong pemilih dan sukar tumbuh.

 Vitamin yang larut dalam lemak, yakni vitamin A, D, E, tidak dibutuhkan oleh kebanyakan jasad renik, sedangkan vitamin K hanya dibutuhkan oleh bakteri yang tergolong dalam jenisMycobacterium dan Bacterioides, yang berfungsi sebagai pengganti untuk koenzim Q(benzoquinon) dalam sistem tranpor elektron (respirasi). Vitamin C tidak berfungsi sebagai faktor pertumbuhan beberapa mikroba karena diduga dapat mengatur potensi oksidasi reduksiyang tepat terhadap medium. Asam Lemak hanya dibutuhkan oleh beberapa mikroba, terutanma jika di dak=lam medium tidak ad vitamin B, sedangkan sterol hanya dibutuhkan oleh Mycoplasma.

· Tersedianya Air

 Sel jasad renik memerlukan air untuk hidup dan berkembang biak. Pertumbuhan jasad renik di dalam suatu bahan sangat dipengaruhi oleh jumlah air yang tersedia. Selain merupakan bagian terbesar komponen sel (70-80%), air juga dibutuhkan sebagai reaktan dalam berbagai reaksi biokimia. Tidak semua air yang tersedia dapat digunakan oleh jasad renik.

Beberapa keadaan dimana air tidak dapt digunakan oleh jasad renik, antara lain adalah: (1) adanyasolut dan ion yang dapat mengikat air di dalam larutan, misalnya adanya gula dan garam, (2)koloid hidrofilik (gel), sebanyak 3-4% dapat mengahambat pertumbuhan mikroba dalam medium, (3) air dalam bentuk kristal es (hidrasi) juga tidak dapt digunakan oleh jasad renik.

· Nilai pH

 Nilai pH medium sangat berpengaruh pada jenis mikroba yang tumbuh . Jasda renik pada umumnya dapat tumbuh pada kisaran pH 3-6 unit. Kebanyakan bakteri mempunyai pH optimum,yakni pH di mana pertumbuhannya optimum, sekitar pH6,5-7,5. Pada phdi bawah 5,0 dan di atas 8,5, bakteri tidak dapat tumbuh dengan baik, kecuali bakteri asam asetat (Acetobacter suboxydans) dan bakteriyang mengoksidasi sulfur. Sebaliknya, khamir menyukai pH 4-5 dan dapat tumbuh pada kisaran pH 2,5-8,5. Oleh karena itu, khamir tumbuh pada pH rendah di mana pertumbuhan bakteri terhambat. Kapang mempunyai pH optimum 5,7, tetapi seperti halnya khamir, kapang masih dapat hidup pada pH 3,0-8,5.

· Suhu

 Masing-masing jasad reknik mempunyai suhu optimum, minimum, dan maksimum untuk pertumbuhannya. Hal ini di sebabkandi bawah suhu minimum dan di atas suhu maksimum, aktivitas enzim akan berhenti, bahkan pada suhu yang terlalu tinggi akan terjadi denaturasi enzim.

Jasad renik dapat dibedakan menjadi beberapa kelompok berdasarkan atas kemampuannya untuk dapat memulai pertumbuhan pada kisaran suhu tertentu. Penggolongan tersebut yaitu : (a) psikrofil, (b) mesofi, (c) termofil.

Kapang dan khamir pada umumnya tergolong mesofil. Karena itu, dapat tumbuh dengan baik pada makanan yang disimpan pada suhu kamar, bahkanpada beberapa mikrobe dapat tumbuh pada suhu pendinginan. Makanan yang disimpandalm lemari es masih mungkin ditumbuhi oleh jasad renik tergolong psikrofil, sedangkan makanan yang disimpan dalam keadaan panas, mungkin masih dapat ditumbuhi oleh mikrobe termofil.

· Tersedianya Oksigen

 Konsentrasi oksigen di alam mempengaruhi jenis mikrobe yang dapat tumbuh. Jasadrenik dapat dibedakan menjadi 4 kelompok berdasarkan kebutuhannya akan oksigen untuk pertumbuhannya, yakni jasad renik bersifat aerob, anaerob, anaerob fakultatif, dan mikroaerofil. Kapang dan khamir pada umumnya bersifat aerob, sedangkan bakteri dapat bersifat aerob atau anaerob.

DISKUSI

1. Jelaskan apa yang terjadi pada kultur bakteri saat fase lag ?

Jawab :

Bila jasad renik dipindahkan ke dalam suatu medium, mula-mula akan mengalami fase adaptasi. Fase iniuntuk menyesuaikan diri dengan substrat dan kondisi lingkungan di sekitarnya. Fase ini belum terjadi pembelahan sel karena beberapa enzim mungkin belum disintesis. Jumlah sel pada fase ini mungkin tetap, tetapi kadang-kadang menurun. Lamanya fase ini bervariasi,dapat cepat atau lambat tergantung dari kecepatan penyesuaian dengan lingkungan di sekitarnya.

Lamanya fase adaptasi dipengaruhi oleh beberapa faktor, di antaranya adalah sebagai berikut:

(c) Medium dan lingkungan pertumbuhan. Sel yang ditempatkan pada medium dan lingkungan pertumbuhan sama seperti medium dan lingkungan sebelumnya, mungkintidak diperlukan waktu adaptasi. Tetapi jika nutrien yang tersedia dan kondisi lingkungan yang baru sangat berbeda dengan sebelumnya, diperlukan waktu penyesuaian untuk mensintesis enzim-enzim yang dibutuhkan untuk metabolisme.

(d) Jumlah inokulum. Jumlah sel yang semakin tinggi akan mempercepat proses adaptasi. Fase adaptasi mungkin berjalan lambat karena beberapa sebab, misalnya : (1) kultur dipindahkan dari medium yang kaya nutrien ke medium yang kandungan nutriennya terbatas, (2) mutan yang baru terbentuk menyesuaikan diri dengan lingkungannya, (3) kultur yang dipindahkan dari fase statis ke medium baru dengan komposisi sama seperti sebelumnya.

2. Sebutkan faktor – faktor yang menyebabkab terjadinya fase stasioner pada kultur bakteri !

Jawab :

Pada fase ini jumlah populasi sel tetap karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel yang mati. Ukuran sel pada fase ini lebih kecil karena sel tetap membelah meskipun zat nutrisi sudah habis. Karena kekurangan zat nutrisi, maka kemungkinan sel tersebut mempunyai komposisi berbeda dengan sel yang tumbuh pada fase logaritma . Pada fase ini sel-sel menjadi lebih tahan terhadap keadaan ekstrem seperti panas, dingin, radiasi dan bahan kimia.

3. Jelaskan apa yang dimaksud dengan waktu generasi !

Jawab :

Waktu yang dibutuhkan oleh mikroba untuk mengganda dari satu individu menjadi dua individu kemudian empat individu dan seterusnya.

4. Bisakah waktu generasi dihitung dari fase apapun dari kurva pertumbuhan ?

Jawab :

Tidak bisa. Pada saat fase lag belum terjadi pembelahan sel karena beberapa enzim belum disintesis. Jumlah sel pada fase ini mungkin tetap, tetap kadang – kadang menurun.Jika pada fase statis jumlah selnya tidak berubah karena jumlah kelahiran sama dengan jumlah kematian.

5. Apakah waktu generasi merupakan parameter yang berguna untuk menunjukkan tipe media apa yang terbaik untuk pertumbuhan suatu organisme spesifik ?

Jawab :

Ya bisa. Karena semakin cepat ia bereproduksi berarti ia mampu beradaptasi dengan substratnya. Itu berarti bahwa substrat tersebut memenuhi faktor – faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba.

KESIMPULAN

1. Fase – fase yang terjadi pada kurva pertumbuhan mikroba adalah

· Fase Lag ( fase adaptasi )

· Fase Log ( Fase eksponensial atau fase pembiakan cepat )

· Fase Statsioner ( statis )

· Fase Kematian

2. Kurva pertumbuhan bakteri merupakan korelasi antara peningkatan jumlah sel dengan terhadap waktu inkubasi.

3. Waktu generasi adalah waktu yang dibutuhkan mikroba untuk membelah, darisatu menjadi dua kemudian jadi empat dan seterusnya.

DAFTAR PUSTAKA

1. Waluyo,Lud.Drs.M.Kes.2004.Mikrobiologi Umum.Universitas Muhammadiyah Press : Malang.

2.Schlegel,H.G. dan Schmidt, K.1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press : Yogyakarta.