LAPORAN PEWARNAAN BAKTERI ( PEWARNAAN GRAM )

Laporan pewarnaan gram

A.    Tujuan

Mengetahui bakteri gram positif dan bakteri gram negatif

B.     Dasar Teori

Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :

1.  Pewarnaan sederhana

Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

a.       pewarnaan asam

Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.

b.      Pewarnaan Basa

Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

2.  Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

a.  Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.

b.  Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat	Bakteri garam (+)	Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel	Kandungan lipid rendah (1-4%)	Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap penisilin	Lebih sensitif	Lebih tahan
Penghambatan oleh pewarna basa (VK)	Lebih dihambat	Kurang dihambat
Kebutuhan nutrisi	Kebanyakan spesies relatif kompleks	Relatif sederhana
Ketahanaa terhadap perlakuan fisik	Lebih tahan	Kurang tahan

(Manurung, 2010).

Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh – Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).

4.  Pewarnaan Khusus

Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010)

a.  Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap.

b.  Pewarnaan spora

Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat.

c.  Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

d.  Pewarnaan nucleoid

Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi, 2010).

A.    Alat dan Bahan

NO	Alat	Jumlah	Bahan
1	Jarum ose	1	Biakan murni B. cereus dan E.colipada medium NA yang berumur 24 jam
2	Pembakar spirtus	1	Aquades steril
3	Kaca preparat	1	Larutan hucker’s crystal violet
4	Pipet tetes	1	Larutan mordan lugol iodine
5	Mikroskop	1	Larutan alkohol 96%
6	Gelas kimia	3	Larutan safranin
7	Kaca objek	1
8	Tabung reaksi	1

B.    

Kaca Objek

Cara Kerja

 

Dibersihkan dengan menggunakan alkohol

Dikeringkan dengan cara dianging-anginkan pada api

Kaca objek yang telah steril

Ditetesi aquades

Jarum ose

 

Dibakar sampai merah

Dicelupkan pada alkohol

Jarum ose yang steril

Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada api

Sampel e.coli dan Bacillus

 

 Diambil menggunakan jarum ose (medianya jangan sampai terambil).

 Disimpan di atas kaca objek

 Aduk pelan-pelan sampai tercampur dengan aquades yang telah ada   pada kaca objek

Kaca objek yang telah berisi sampel

             Dikeringkan dengan cara dipanaskan di atas api kecil.

                 

      Ditetesi violet sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)               

      Dicuci dengan air yang mengalir

     Ditetesi lugol sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)

      Dicuci dengan air yang mengalir

     Ditetesi alkohol 96% ( diamkan selama 45 detik)

     Dicuci dengan air yang mengalir

      Ditetesi safranin sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)

       Dicuci dengan air yang mengalir

      Dikeringkan pada udara terbuka

Hasil

     Diamati dibawah mikrosko

A.  Hasil Pengamatan dan Pembahasan

Tabel pengamatan

Gambar 1. Fiksasi Sumber : dokumentasi Pribadi	Bakteri yang telah di ambil kemudian di simpan pada kaca objek yang dicampur dengan setetes aquades. Setelah itu difiksasi di atas api sampai kering. Pemanasan tidak boleh terlalu panas karena bisa merusak sel bakteri.
Gambar 2. Pada saat ditetesi violet Sumber : dokumentasi pribadi	Setelah difiksasi, sampel ditetesi violet. Sampai bakteri terendam. Lalu biarkan selama 1 menit. Setelah itu, cuci di air yang mengalir. Hasilnya terdapat warna ungu pada kaca objek.
Gambar 3. Penambahan lugol Sumber : dokumentasi pribadi	Kemudian bakteri ditetesi lugol sampai terendam lalu biarkan 1 menit dan cuci di air yang mengalir. Setelah dicuci, kaca objek tetap berwarna ungu akibat dari tetesan violet.
Gambar 4. Saat ditetesi alkohol 96% Sumber : dokumentasi pribadi	Setelah ditetesi lugol dan dicuci, bakteri ditetesi alkohol 96% dan dibiarkan selama 45 detik. Setelah itu, cuci di air yang mengalir. Setelah dicuci, warna ungu pada kaca objek menghilang akibat penambahan dari alkohol.
Gambar 5. Pada saat ditetesi safranin Sumber : dokumentasi pribadi	Setelah warna ungu pada bakteri hilang, kemudian bakteri ditetesi safranin sampai terendam dan biarkan selama 1 menit. Kemudian cuci di air yang mengalir. Hasilnya, bakteri yang dihasilkan berwarna merah muda. Gambar 6. Hasil pewarnaan Sumber :  dokumentasi pribadi

Gambar 7. Hasil pengamatan pada mikroskop (pembesaran 40x10)

Sumber : dokumentasi pribadi

Gambar B. cereus pada  pembesaran 16x10

Sumber : Purna,2012.laporan praktikum mikrobiologi

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).

Penambahan violet pada bakteri. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Penambahan lugol pada bakteri. Lugol  merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol  yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas objek glass tersebut kemudian didiamkan selama 45 detik. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas kaca objek tersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, kaca objek dibilas dengan air hingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objekdengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari air dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

B.     Kesimpulan

Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, bakteri e.coli yang berwarna merah merupakan gram negatif dan bacillus yang berwarna ungu merupakan gram positif.

Daftar Pustaka

Aditya,Mushoffa.2010.Teknik Pewarnaan Bakteri.

http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 11 November 2010

Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif).http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-gram-negatif. 11 November 2010.

Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.

Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum. Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.

Manurung, Pebrin.2010.Pengamatan Bentuk Bakteri.

http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri.html. 11 November 2010.

Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi UNS.