I. TUJUAN
Memberi pengetahuan dan keterampilan mahasiswa dalam hal : dasar kimiawi dan teoritis pewarnaan biologis, teknik preparasi smear, serta pewarnaan sederhana dan diferensiasi.
II. BAHAN PRAKTIKUM
1. Pseudomonas sp;
2. Bacillus subtilis;
3. Staphylococcus aereus;
4. Kristal violet, iodine, safranin, alkohol, Malachit Green;
5. Akuades.
III. ALAT PRAKTIKUM
1. Tabung;
2. Rak tabung reaksi;
3. Bunsen;
4. Mikroskop cahaya.
5. Objek glass;
6. Cover glass;
7. Tissue;
8. Jarum ose;
9. Wadah pengering;
IV. LANDASAN TEORI
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain tidak berwarna, bakteri itu juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut, maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itulah pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian mikrobiologi. Adapun macam-macam pewarnaan, antara lain :
1. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan dengan menggunakan satu jenis pewarna saja dengan tujuan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarna basa pada umumnya, antara lain : kristal violet, metylen blue, karbol fuchsin, dan safranin.
2. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D.
3. Pewarnaan Kapsul
Pewarnaan ini mengunakan dua reagen, yaitu: kristal violet sebagai dekolorisator (penghapus warna utama) serta kopper sulfat sebagai pewarna tandingan teradsorbsi bahan kapsular yang mengalami dekolorisasi. Hasil pewarnaannya ialah kapsul akan berwarna biru terang kontras dengan warna ungu gelap dari sel.
4. Pewarnaan Spora
Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada Bacillus subtilis.
Teknik- teknik pewarnaan secara umum, antara lain :
A. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan ini digunakan untuk visualisasi bentuk morfologis yang berupa basil, kokus, basil, vibrio dan spiral), dan susunan (rantai, gerombol, berpasangan, dan tetrad).
B. Pewarnaan diferensial
Pewarnaan ini digunakan untuk pemisahan dalam kelompok yang terbagi menjadi dua, yaitu pewarna gram dan pewarna tahan asam. Selain itu juga digunakan untuk visualisasi struktur yang dibedakan menjadi empat, yaitu pewarna kapsul, pewarna flagel, pewarna spora, dan pewarna inti.
V. CARA KERJA
A. Pewarnaan Sederhana
1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide;
2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen;
3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass;
4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen;
5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali;
6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering;
7. Meneteskan kristal violet hingga menutupi permukaan bakteri;
8. Mendiamkannya selama 1 menit;
9. Membilas pewarna kristal violet dengan akuades;
10. Membersihkan sisa air akuades dengan menggunakan tissue kering;
11. Menutup bakteri dengan menggunakan cover glass;
12. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati,
13. Mengamati slide tersebut.
B. Pewarnaan Gram
1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide;
2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen;
3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass;
4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen;
5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali;
6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering;
7. Meneteskan kristal violet hingga menutupi permukaan bakteri;
8. Mendiamkannya selama 1 menit;
9. Membilas pewarna kristal violet dengan akuades;
10. Meneteskan iodine hingga menutupi permukaan bakteri kemudian mendiamkannya selama kurang lebih 1-2 menit;
11. Membilas biakan tadi dengan air akuades;
12. Meneteskan alkohol 95% ke atas bakteri kemudian mendiamkannya selama 30 detik;
13. Membilasnya dengan air akuades;
14. Meneteskan safranin ke atas bakteri dan mendiamkannya selam kurang lebih 1 menit, kemudian membilasnya dngan air akuades;
15. Membersihkan sisa air akuades dengan menggunakan tissue kering;
16. Menutup bakteri dengan menggunakan cover glass;
17. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati,
18. Mengamati slide tersebut.
C. Pewarnaan Spora
1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide;
2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen;
3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass;
4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen;
5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali;
6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering;
7. Setelah tampak keputih-putihan pada objek glass tersebut, kemudian merendam dengan malachit green selama 10 menit;
8. Melewatkan objek glass tersebut di atas api bunsen dengan tidak terlalu sering, dan jika pewrana sudah kering, perlu ditambhkan lagi pewarna tersebut (diusahakan selama 10 menit tersebut malachit green tidak kering);
9. Setelah 10 menit, mencuci objek glass dengan akuades hingga warna hilang;
10. Mengeringkan sisa pencucian tado dengan tisue kering;
11. Merendam dengan safranin selama 1 menit;
12. Mencuci kembali dengan akuades;
13. Mengeringkan slide dengan dilewatkan pada api bunsen;
14. Menutup dengan cover glass;
15. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati;
16. Mengamati slide tersebut.
VI. HASIL PENGAMATAN
No Bakteri Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Gram Pewarnaan spora
1 Bacillus subtilis Strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil), susunan bekterinya berantai. Termasuk gram positif. Memiliki endospora.
2 Staphylococcus aureus
Berbentuk coccus, susunan bakterinya bergerombol seperti buah anggur. Termasuk gram positif.
3 Pseudomonas putida Berbentuk batang pendek (cocoid), susunan bakterinya tunggal. Termasuk gram negatif.
VII. PEMBAHASAN
a. Pewarnaan Sederhana
1. Pewarnaan Sederhana pada Bacillus subtilis
Pada pewarnaan sederhana bakteri Bacillus subtilis zat pewarna yang digunakan adalah kristal violet. Biakan murni diambil dari tabung reaksi secara aseptik dan diletakkan langsung pada objek glass kemudian difiksasi agar protein bakteri terkoagulasi serta dapat menempel pada objek glass dan tidak ikut tercuci sewaktu dibilas dengan akuades. Hal yang dilakukan selanjutnya adalah mengamati dalam mikroskop. Sel bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis diantara cover glass dan objek glass masih bisa menampung beberapa bakteri bacillus yang ditumpuk vertikal, artinya tebal tersebut masih bisa digunakan sel untuk berenang ke atas dan ke bawah. Jangan menganggap gambar yang terlihat pada mikroskop adalah gambar datar. Kontrol sangatlah penting, meskipun kita sulit untuk mendapatkannya. Akan tetapi lebih baik jika bakteri yang dilihat dapat dibandingkan dengan bakteri lain yang telah diketahui bentuknya dengan pasti. Dari pengamatan mikroskopis diperoleh bentuk morfologi dari bakteri Bacillus subtilis yaitu strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil), dan susunan bakterinya adalah berantai.
2. Pewarnaan Sederhana pada Pseudomonas putida
Pada pengecatan mikroba jenis Pseudomonas putida dilakukan pengecatan dengan menggunakan zat warna basa kristal violet. Pertama jarum inokulasi disterilkan lalu kemudian mulut tabung reaksi disterilkan juga di api bunsen, kemudian mikroba yang ada di tabung reaksi (media agar miring) diambil dan diletakkan di objek glass, sebelumnya objek glass sudah diberi air sedikit. Kemudian setelah mikroba dan air dicampur, dilakukan metode smear yaitu meratakan mikroba kira-kira membentuk sebuah bentuk koin. Kemudian dilakukan fiksasi yaitu dengan melewatkan smear secara cepat di api bunsen, lalu dikering-anginkan. Setelah melakukan metode smear, selanjutnya adalah metode pengecatan. Objek glass yang sudah di titrasi diberi pewarna kristal violet (selama 60 detik). Kemudian diberi air aquades untuk membersihkan kelebihan warna. Sisa-sisa air yang ada di objek glass dibersihkan dengan tissue. Terakhir objek glass ditutup dengan cover glass, dan diletakkan di mikroskop cahaya untuk diamati dengan perbesaran 1000 X dengan catatan menggunakan minyak emersi setelah menemukan titik fokus perbesaran 40 X.
3. Pewarnaan sederhana pada Staphylococcus aureus
Kaca preparat diberi setetes air dan diberi bakteri Stapylococcus aureus, kemudian dipaskan di atas api bunsen, dari sini akan nampak lapisan putih yang tipis, semitransparan, dan rata yang menunjukkan adanya bakteri. Setelah smear difiksasi, smear kemudian diberi pewarna basa yaitu metilen blue. Dalam pemberian metilen blue ini, diusahakan agar menutupi semua lapisan tipis smear. Pewarnaan dengan menggunakan metilen biru dibutuhkan waktu 2-60 detik, setelah itu dicuci dengan aquades. Dari sini akan nampak lapisan yang sebelumnya berwarna putih tipis dan semitransparan, akan berubah warna menjadi biru transparan. Selanjutnya adalah milangkan sisa aquades dengan menggunakan kertas tissue. Setelah itu dilihat dalam mikroskop dengan perbesaran 1000 X. dalam mikroskop akan nampak bakteri Stapylococcus aereus berwarna biru matang dan bentuk bulat berantai.
B. Pewarnaan Gram
1. Pewarnaan gram pada Bacillus subtilis
Pada pewarnaan ini digunakan empat pewarna, yaitu Kristal violet sebagai pewarna utama, iodine sebagai pengikat warna utama (mordant), alcohol sebagai dekolorisasi, dan safranin sebagai pewarna tandingan. Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak Bacillus subtilis berbentuk basil
(batang) dan merupakan bakteri gram positif. Ini bisa diketahui saat tahap dekolorisasi. Pada tahap tersebut warna yang dihasilkan sama dengan warna utama, yaitu warna ungu. Ini menunjukkan bahwa pada Bacillus subtilis memiliki dinding yang tebal sehinnga saat bakteri mengalami dehidrasi, pori-porinya menciut yang akhirnya menyebabkan warna utama tidak bisa keluar. Pada Bacillus subtilis, koloninya bergerombol sedikit terpisah-pisah bahkan membentuk rantai panjang.
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol.
2. Pewarnaan Gram pada Pseudomonas putida
Pada pengamatan genus Pseudomonas dengan menggunakan pewarnaan gram, kami menggunakan bakteri Pseudomonas putida sebagai contoh yang mewakili. Sebelum mewarnai perlu difiksasi di atas api bunsen, pertama kali, koloni bakteri disuspensikan secara tipis di atas akuades. Smear yang tipis memberikan hasil pada gelas objek dan dihomogenkan .Selanjutnya dilanjutkan dengan tehnik pewarnaan. Pertama, menggunakan Gram A yaitu kristal violet, bakteri tampak terwarnai ungu. Fungsi dari gram A adalah sebagai pewarna utama yaitu pewarna yang pertama kali digunakan. Baik bakteri gram positif maupun gram negatif memberikan warna yang sama pada pewarnaan dengan Gram A. Setelah itu, diberikan perlakuan dengan Gram B yaitu iodin. Fungsi dari iodin adalah sebagai mordant atau penguat warna. Kompleks UK-Y dapat terbentuk di dalam sel. Dengan begitu, warna dari kristal violet tetap terjaga. Kemudian dilanjutkan dengan pemberian Gram C yaitu alkohol, yaitu berfungsi sebagai peluntur warna (dekolorisasi) dan dehidrasi sel. Pada saat itu, di dalam dinding sel bakteri Pseudomonas yang tersusun atas selapis sel yang tersusun atas lipid. Lipid tereksitasi dari dinding sel,pori-pori dinding sel bakteri mengembang. Kompleks UK-Y keluar dari sel sehingga sel menjadi tidak berwarna. Terakhir diberi pewarna tandingan yaitu safranin. Pewarna tandingan dapat masuk apabila pewarna utamanya telah keluar dari sel bakteri. Bakteri pseudomonas dapat terwarnai merah. Dari uraian di atas, dapat dilihat bahwa Pseudomonas putida memiliki karateristik mikroskopik sebagai berikut yang diamati di bawah mikroskop cahaya yaitu :
• Gram-negatif;
• Berbentuk kokoid (batang pendek);
• Tidak membentuk spora.
3. Pewarnaan gram pada Staphylococcus aureus
Pewarnaan gram bertujuan untuk mengelompokkan bakteri kedalam bakteri negatif dan bakteri positif. Staphylococcus aureus adalah bakteri gram positif, karena bakteri tersebut tetap mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga koloni bakteri tampak berwarna ungu atau biru. Pemberian alkohol berfungsi untuk dekolorisasi bakteri, sehingga menyebabkan zat utama dalam sel muncul, namun pada bakteri Staphylococcus aureus yang termasuk gram positif jadi tidak terdekolorisasi, karena bakteri tersebut memiliki membran plasma tunggal yang di kelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan sisanya berupa molekul lain berupa molekul lain bernama asam teikhuat. Pada proses pewarnaan terakhir adalah dengan pemberian safranin. Proses pewarnaan ini akan menghasilkan bakteri dengan sel yang berwarna ungu tua atau biru, dan kapsul yang berwarna biru terang. Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif yang tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter tiap sel 0,8 – 1,0 µm. Bakteri tersebut tumbuh optimum pada suhu 37º dengan waktu pembelahan 0,47/jam. Bakteri tersebut merupakan bakteri virulensi karena menghasilkan kapsul yang tebal untuk melindungi diri dari fagositosis host, selain itu bakteri tersebut merupakan bakteri patogen.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut:
1. Fase yang paling kritis dari prosedur pewarnaan gram adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV- iodine lepas dari sel. Pemberian alkohol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan dekolorisasi yang berlebih sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan alkohol yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
2. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur.
C. Pewarnaan Spora
1. Pewarnaan Spora pada Bacillus subtilis
Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, akan tetapi apabila sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya.
Bacillus subtilis memiliki endospora, endospora lebih tahan lama meski dalam keadaan lingkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan kimia yang beracun. Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari saftranin tetap berwarna hijau karena spora sudah mengkiat malachit green dan sulit mengikat warna yang diberikan kemudian.
VIII. KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :
1. Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan pengecatan gram, pengecatan sederhana, dan pengecatan spora.
2. Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, sedangkan pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna.
3. Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu.
4. Pengecatan spora dilakukan dengan memberi warna pada endospora suatu bakteri. Zat pewarna yang digunakan pertama adalah malachit green. Pengecatan spora digunakan untuk mengetahui spora dengan sel vegatatifnya.
5. Pada preparasi smear, ketebalan smear sangat penting dalam pengamatan di mikroskop. Smear yang baik hanya sekali, jika sudah kering, akan nampak lapisan putih yang tipis.
6.Fiksasi panas adalah teknik yang dilakukan supaya smear bakteri tidak tercuci selama prosedur pewarnaan. Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan secara cepat smear yang dikering-anginkan dua-tiga kali pada api bunsen.
7. Pada bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus termasuk dalam gram positif dikarenakan bakteri tersebut berwarna biru atau ungu pada pewarnaan safranin. Sedangkan bakteri Pseudomonas putida termasuk dalam gram negatif dikarenakan bakteri tersebut berwarna merah pada pewarnaan safranin.
IX. DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2009.http://www.microbiologybytes.com/video/Pputida.html. Diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:09.
Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.
Ekmon, 2008. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasi-bakteri.html) diakses pada 29 Oktober 2010 13:28.
Jimmo., 2008. http ://Pembuatan PreParAT dannn PengeCaTAnnyA__ BloG Kita.mht ,. diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:29.
Nurodin, Ade., 2009. http://adenurodin.blogspot.com/2009/12/pembuatan-preparat-bakteri-pewarnaan.html diakses pada 29 Oktober 2010 13:17.
Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.
Stanier Roger, Edward Alderberg dan John Ingraham. 1982. Dunia Mikroba 1. Jakarta: Bharata Karya Aksara.
Memberi pengetahuan dan keterampilan mahasiswa dalam hal : dasar kimiawi dan teoritis pewarnaan biologis, teknik preparasi smear, serta pewarnaan sederhana dan diferensiasi.
II. BAHAN PRAKTIKUM
1. Pseudomonas sp;
2. Bacillus subtilis;
3. Staphylococcus aereus;
4. Kristal violet, iodine, safranin, alkohol, Malachit Green;
5. Akuades.
III. ALAT PRAKTIKUM
1. Tabung;
2. Rak tabung reaksi;
3. Bunsen;
4. Mikroskop cahaya.
5. Objek glass;
6. Cover glass;
7. Tissue;
8. Jarum ose;
9. Wadah pengering;
IV. LANDASAN TEORI
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain tidak berwarna, bakteri itu juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut, maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itulah pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian mikrobiologi. Adapun macam-macam pewarnaan, antara lain :
1. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan dengan menggunakan satu jenis pewarna saja dengan tujuan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarna basa pada umumnya, antara lain : kristal violet, metylen blue, karbol fuchsin, dan safranin.
2. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D.
3. Pewarnaan Kapsul
Pewarnaan ini mengunakan dua reagen, yaitu: kristal violet sebagai dekolorisator (penghapus warna utama) serta kopper sulfat sebagai pewarna tandingan teradsorbsi bahan kapsular yang mengalami dekolorisasi. Hasil pewarnaannya ialah kapsul akan berwarna biru terang kontras dengan warna ungu gelap dari sel.
4. Pewarnaan Spora
Pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan menggunakan malchit green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaanya akan muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya, yaitu pada Bacillus subtilis.
Teknik- teknik pewarnaan secara umum, antara lain :
A. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan ini digunakan untuk visualisasi bentuk morfologis yang berupa basil, kokus, basil, vibrio dan spiral), dan susunan (rantai, gerombol, berpasangan, dan tetrad).
B. Pewarnaan diferensial
Pewarnaan ini digunakan untuk pemisahan dalam kelompok yang terbagi menjadi dua, yaitu pewarna gram dan pewarna tahan asam. Selain itu juga digunakan untuk visualisasi struktur yang dibedakan menjadi empat, yaitu pewarna kapsul, pewarna flagel, pewarna spora, dan pewarna inti.
V. CARA KERJA
A. Pewarnaan Sederhana
1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide;
2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen;
3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass;
4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen;
5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali;
6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering;
7. Meneteskan kristal violet hingga menutupi permukaan bakteri;
8. Mendiamkannya selama 1 menit;
9. Membilas pewarna kristal violet dengan akuades;
10. Membersihkan sisa air akuades dengan menggunakan tissue kering;
11. Menutup bakteri dengan menggunakan cover glass;
12. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati,
13. Mengamati slide tersebut.
B. Pewarnaan Gram
1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide;
2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen;
3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass;
4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen;
5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali;
6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering;
7. Meneteskan kristal violet hingga menutupi permukaan bakteri;
8. Mendiamkannya selama 1 menit;
9. Membilas pewarna kristal violet dengan akuades;
10. Meneteskan iodine hingga menutupi permukaan bakteri kemudian mendiamkannya selama kurang lebih 1-2 menit;
11. Membilas biakan tadi dengan air akuades;
12. Meneteskan alkohol 95% ke atas bakteri kemudian mendiamkannya selama 30 detik;
13. Membilasnya dengan air akuades;
14. Meneteskan safranin ke atas bakteri dan mendiamkannya selam kurang lebih 1 menit, kemudian membilasnya dngan air akuades;
15. Membersihkan sisa air akuades dengan menggunakan tissue kering;
16. Menutup bakteri dengan menggunakan cover glass;
17. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati,
18. Mengamati slide tersebut.
C. Pewarnaan Spora
1. Mensterilkan objek glass dengan melakukan preparasi slide;
2. Mensterilkan jarum ose dengan dilewatkan pada api bunsen;
3. Memberi setetes akuades dengan kondisi tidak perlu tebal dan juga tidak perlu tipis pada objek glass;
4. Mengambil biakan dengan menggunakan jarum ose yang sudah steril, dengan satu arah, dari baewah ke atas. Cukup satu ose saja dan tidak boleh terlalu jauh dari api bunsen;
5. Menyebarkan jarum ose yang berisi mikroba tersebut dengan merata, persis di atas genangan air pada objek glass tadi. Setelah pengambilan, ose disterilkan kembali;
6. Melewatkan objek glass yang berisi mikroba tersebut pada api bunsen hingga kering;
7. Setelah tampak keputih-putihan pada objek glass tersebut, kemudian merendam dengan malachit green selama 10 menit;
8. Melewatkan objek glass tersebut di atas api bunsen dengan tidak terlalu sering, dan jika pewrana sudah kering, perlu ditambhkan lagi pewarna tersebut (diusahakan selama 10 menit tersebut malachit green tidak kering);
9. Setelah 10 menit, mencuci objek glass dengan akuades hingga warna hilang;
10. Mengeringkan sisa pencucian tado dengan tisue kering;
11. Merendam dengan safranin selama 1 menit;
12. Mencuci kembali dengan akuades;
13. Mengeringkan slide dengan dilewatkan pada api bunsen;
14. Menutup dengan cover glass;
15. Memberi minyak emersi di atas cover glass pada objek yang akan kita amati;
16. Mengamati slide tersebut.
VI. HASIL PENGAMATAN
No Bakteri Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Gram Pewarnaan spora
1 Bacillus subtilis Strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil), susunan bekterinya berantai. Termasuk gram positif. Memiliki endospora.
2 Staphylococcus aureus
Berbentuk coccus, susunan bakterinya bergerombol seperti buah anggur. Termasuk gram positif.
3 Pseudomonas putida Berbentuk batang pendek (cocoid), susunan bakterinya tunggal. Termasuk gram negatif.
VII. PEMBAHASAN
a. Pewarnaan Sederhana
1. Pewarnaan Sederhana pada Bacillus subtilis
Pada pewarnaan sederhana bakteri Bacillus subtilis zat pewarna yang digunakan adalah kristal violet. Biakan murni diambil dari tabung reaksi secara aseptik dan diletakkan langsung pada objek glass kemudian difiksasi agar protein bakteri terkoagulasi serta dapat menempel pada objek glass dan tidak ikut tercuci sewaktu dibilas dengan akuades. Hal yang dilakukan selanjutnya adalah mengamati dalam mikroskop. Sel bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis diantara cover glass dan objek glass masih bisa menampung beberapa bakteri bacillus yang ditumpuk vertikal, artinya tebal tersebut masih bisa digunakan sel untuk berenang ke atas dan ke bawah. Jangan menganggap gambar yang terlihat pada mikroskop adalah gambar datar. Kontrol sangatlah penting, meskipun kita sulit untuk mendapatkannya. Akan tetapi lebih baik jika bakteri yang dilihat dapat dibandingkan dengan bakteri lain yang telah diketahui bentuknya dengan pasti. Dari pengamatan mikroskopis diperoleh bentuk morfologi dari bakteri Bacillus subtilis yaitu strukutr morfologinya berbentuk batang (bacil), dan susunan bakterinya adalah berantai.
2. Pewarnaan Sederhana pada Pseudomonas putida
Pada pengecatan mikroba jenis Pseudomonas putida dilakukan pengecatan dengan menggunakan zat warna basa kristal violet. Pertama jarum inokulasi disterilkan lalu kemudian mulut tabung reaksi disterilkan juga di api bunsen, kemudian mikroba yang ada di tabung reaksi (media agar miring) diambil dan diletakkan di objek glass, sebelumnya objek glass sudah diberi air sedikit. Kemudian setelah mikroba dan air dicampur, dilakukan metode smear yaitu meratakan mikroba kira-kira membentuk sebuah bentuk koin. Kemudian dilakukan fiksasi yaitu dengan melewatkan smear secara cepat di api bunsen, lalu dikering-anginkan. Setelah melakukan metode smear, selanjutnya adalah metode pengecatan. Objek glass yang sudah di titrasi diberi pewarna kristal violet (selama 60 detik). Kemudian diberi air aquades untuk membersihkan kelebihan warna. Sisa-sisa air yang ada di objek glass dibersihkan dengan tissue. Terakhir objek glass ditutup dengan cover glass, dan diletakkan di mikroskop cahaya untuk diamati dengan perbesaran 1000 X dengan catatan menggunakan minyak emersi setelah menemukan titik fokus perbesaran 40 X.
3. Pewarnaan sederhana pada Staphylococcus aureus
Kaca preparat diberi setetes air dan diberi bakteri Stapylococcus aureus, kemudian dipaskan di atas api bunsen, dari sini akan nampak lapisan putih yang tipis, semitransparan, dan rata yang menunjukkan adanya bakteri. Setelah smear difiksasi, smear kemudian diberi pewarna basa yaitu metilen blue. Dalam pemberian metilen blue ini, diusahakan agar menutupi semua lapisan tipis smear. Pewarnaan dengan menggunakan metilen biru dibutuhkan waktu 2-60 detik, setelah itu dicuci dengan aquades. Dari sini akan nampak lapisan yang sebelumnya berwarna putih tipis dan semitransparan, akan berubah warna menjadi biru transparan. Selanjutnya adalah milangkan sisa aquades dengan menggunakan kertas tissue. Setelah itu dilihat dalam mikroskop dengan perbesaran 1000 X. dalam mikroskop akan nampak bakteri Stapylococcus aereus berwarna biru matang dan bentuk bulat berantai.
B. Pewarnaan Gram
1. Pewarnaan gram pada Bacillus subtilis
Pada pewarnaan ini digunakan empat pewarna, yaitu Kristal violet sebagai pewarna utama, iodine sebagai pengikat warna utama (mordant), alcohol sebagai dekolorisasi, dan safranin sebagai pewarna tandingan. Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak Bacillus subtilis berbentuk basil
(batang) dan merupakan bakteri gram positif. Ini bisa diketahui saat tahap dekolorisasi. Pada tahap tersebut warna yang dihasilkan sama dengan warna utama, yaitu warna ungu. Ini menunjukkan bahwa pada Bacillus subtilis memiliki dinding yang tebal sehinnga saat bakteri mengalami dehidrasi, pori-porinya menciut yang akhirnya menyebabkan warna utama tidak bisa keluar. Pada Bacillus subtilis, koloninya bergerombol sedikit terpisah-pisah bahkan membentuk rantai panjang.
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol.
2. Pewarnaan Gram pada Pseudomonas putida
Pada pengamatan genus Pseudomonas dengan menggunakan pewarnaan gram, kami menggunakan bakteri Pseudomonas putida sebagai contoh yang mewakili. Sebelum mewarnai perlu difiksasi di atas api bunsen, pertama kali, koloni bakteri disuspensikan secara tipis di atas akuades. Smear yang tipis memberikan hasil pada gelas objek dan dihomogenkan .Selanjutnya dilanjutkan dengan tehnik pewarnaan. Pertama, menggunakan Gram A yaitu kristal violet, bakteri tampak terwarnai ungu. Fungsi dari gram A adalah sebagai pewarna utama yaitu pewarna yang pertama kali digunakan. Baik bakteri gram positif maupun gram negatif memberikan warna yang sama pada pewarnaan dengan Gram A. Setelah itu, diberikan perlakuan dengan Gram B yaitu iodin. Fungsi dari iodin adalah sebagai mordant atau penguat warna. Kompleks UK-Y dapat terbentuk di dalam sel. Dengan begitu, warna dari kristal violet tetap terjaga. Kemudian dilanjutkan dengan pemberian Gram C yaitu alkohol, yaitu berfungsi sebagai peluntur warna (dekolorisasi) dan dehidrasi sel. Pada saat itu, di dalam dinding sel bakteri Pseudomonas yang tersusun atas selapis sel yang tersusun atas lipid. Lipid tereksitasi dari dinding sel,pori-pori dinding sel bakteri mengembang. Kompleks UK-Y keluar dari sel sehingga sel menjadi tidak berwarna. Terakhir diberi pewarna tandingan yaitu safranin. Pewarna tandingan dapat masuk apabila pewarna utamanya telah keluar dari sel bakteri. Bakteri pseudomonas dapat terwarnai merah. Dari uraian di atas, dapat dilihat bahwa Pseudomonas putida memiliki karateristik mikroskopik sebagai berikut yang diamati di bawah mikroskop cahaya yaitu :
• Gram-negatif;
• Berbentuk kokoid (batang pendek);
• Tidak membentuk spora.
3. Pewarnaan gram pada Staphylococcus aureus
Pewarnaan gram bertujuan untuk mengelompokkan bakteri kedalam bakteri negatif dan bakteri positif. Staphylococcus aureus adalah bakteri gram positif, karena bakteri tersebut tetap mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan gram, sehingga koloni bakteri tampak berwarna ungu atau biru. Pemberian alkohol berfungsi untuk dekolorisasi bakteri, sehingga menyebabkan zat utama dalam sel muncul, namun pada bakteri Staphylococcus aureus yang termasuk gram positif jadi tidak terdekolorisasi, karena bakteri tersebut memiliki membran plasma tunggal yang di kelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan sisanya berupa molekul lain berupa molekul lain bernama asam teikhuat. Pada proses pewarnaan terakhir adalah dengan pemberian safranin. Proses pewarnaan ini akan menghasilkan bakteri dengan sel yang berwarna ungu tua atau biru, dan kapsul yang berwarna biru terang. Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif yang tidak menghasilkan spora dan tidak motil, umumnya tumbuh berpasangan maupun berkelompok, dengan diameter tiap sel 0,8 – 1,0 µm. Bakteri tersebut tumbuh optimum pada suhu 37º dengan waktu pembelahan 0,47/jam. Bakteri tersebut merupakan bakteri virulensi karena menghasilkan kapsul yang tebal untuk melindungi diri dari fagositosis host, selain itu bakteri tersebut merupakan bakteri patogen.
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut:
1. Fase yang paling kritis dari prosedur pewarnaan gram adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV- iodine lepas dari sel. Pemberian alkohol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan dekolorisasi yang berlebih sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan alkohol yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.
2. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur.
C. Pewarnaan Spora
1. Pewarnaan Spora pada Bacillus subtilis
Endosopora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya, akan tetapi apabila sekali diwarnai, zat warna tersebut akan sulit hilang. Hal inilah yang menjadi dasar dari metode pengecatan spora secara umum. Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, endospora diwarnai pertama dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel vegetatifnya.
Bacillus subtilis memiliki endospora, endospora lebih tahan lama meski dalam keadaan lingkungan ekstrim seperti kering, panas, atau bahan kimia yang beracun. Selain itu, endospora juga lebih tahan terhadap pewarnaan. Sekali berhasil diwarnai, spora sangat sukar untuk melepaskan zat warna sehingga saat diberi warna dari saftranin tetap berwarna hijau karena spora sudah mengkiat malachit green dan sulit mengikat warna yang diberikan kemudian.
VIII. KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :
1. Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan pengecatan gram, pengecatan sederhana, dan pengecatan spora.
2. Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, sedangkan pewarnaan gram digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna.
3. Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu.
4. Pengecatan spora dilakukan dengan memberi warna pada endospora suatu bakteri. Zat pewarna yang digunakan pertama adalah malachit green. Pengecatan spora digunakan untuk mengetahui spora dengan sel vegatatifnya.
5. Pada preparasi smear, ketebalan smear sangat penting dalam pengamatan di mikroskop. Smear yang baik hanya sekali, jika sudah kering, akan nampak lapisan putih yang tipis.
6.Fiksasi panas adalah teknik yang dilakukan supaya smear bakteri tidak tercuci selama prosedur pewarnaan. Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan secara cepat smear yang dikering-anginkan dua-tiga kali pada api bunsen.
7. Pada bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococcus aureus termasuk dalam gram positif dikarenakan bakteri tersebut berwarna biru atau ungu pada pewarnaan safranin. Sedangkan bakteri Pseudomonas putida termasuk dalam gram negatif dikarenakan bakteri tersebut berwarna merah pada pewarnaan safranin.
IX. DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2009.http://www.microbiologybytes.com/video/Pputida.html. Diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:09.
Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.
Ekmon, 2008. http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasi-bakteri.html) diakses pada 29 Oktober 2010 13:28.
Jimmo., 2008. http ://Pembuatan PreParAT dannn PengeCaTAnnyA__ BloG Kita.mht ,. diakses pada tanggal 28 Oktober 2010 20:29.
Nurodin, Ade., 2009. http://adenurodin.blogspot.com/2009/12/pembuatan-preparat-bakteri-pewarnaan.html diakses pada 29 Oktober 2010 13:17.
Schlegel, Hans. 1994. Mikrobiologi Umum Edisi Keenam. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.
Stanier Roger, Edward Alderberg dan John Ingraham. 1982. Dunia Mikroba 1. Jakarta: Bharata Karya Aksara.
X. LAMPIRAN
Bacillus subtilis (sederhana)
Bacillus subtilis (gram +)
Staphylococcus aureus (sederhana)
Staphylococcus aureus (gram +)
Pseudomonas putida (sederhana)
Pseudomonas putida (gram -)
Bacillus subtilis (spora)
you`re welcome
ReplyDeletesama"